抗TP抗体筛查试验的假阳性问题及其对策
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1.梅毒的体外诊断试验分类
梅毒的体外诊断试验按试验所用抗原分为非密螺旋体抗体试验(nontreponemal antibody test, NTrAT)和密螺旋体抗体试验(treponemal antibody test, TrAT)。NTrAT包括快速血浆反应素环状卡片试验(rapid plasma reagin circle card test, RPR)、不加热血清反应素试验、性病研究实验室试验和甲苯胺红不加热血清试验(tolulized red unheated serum test, TRUST)等, 均以心磷脂、胆固醇和磷脂酰胆碱等为抗原检测非特异性的抗心磷脂抗体(反应素), 故存在生物学假阳性。
2.检测特异性抗TP抗体的筛查试验
在检测特异性抗TP抗体的筛查试验中, 荧光TP抗体吸收试验(fluorescent treponemal antibody absorption, FTA-ABS)、TP血球凝集试验(treponema pallidum hemagglutination assay, TPHA)和TP颗粒凝集试验(treponema pallidum particle agglutination assay, TPPA)等已沿用多年, 其中TPPA因凝胶颗粒的均一性较佳而在性能上优于TPHA[26]。这几种试剂制备所用的抗原为TP天然抗原, 来源受限且制备复杂。近年在基因重组TP抗原成功制备的基础上发展的检测抗TP抗体的ELISA和CLIA筛查试验, 因具有检测性能佳、适合自动化批量检测、易标准化且原始资料易保存的特点而得到广泛应用[27, 28, 29, 30]。本节着重讨论ELISA和CLIA检测抗TP抗体筛查试验的假阳性问题及其对策, 因而未将NTrAT检测的生物学假阳性列为主要议题。
二、ELISA和CLIA抗TP抗体筛查试验的假阳性现象及对策
1、ELISA和CLIA抗TP抗体筛查试验的假阳性问题
ELISA和CLIA抗TP抗体筛查试验都存在一定比率的假阳性。刘勇等[31]对经科华ELISA试剂筛查抗TP抗体呈阳性反应的91份样本用欧蒙公司的WB试剂(特异性抗原为Tpn47、 tmpA 、Tpn17 和Tpn15 等 4 种)进行确证试验, 在50岁以下年龄组38份样本中, WB检测1份为阴性(假阳性率为2.63%), 而在50岁及以上年龄组WB检测6份为阴性(假阳性率为15.09%), 总假阳性率为9.89%。北京协和医院陈兰兰等[32]报道, 在Abbott i2000免疫分析仪及化学发光微粒子免疫检测试剂检测呈阳性反应的96份样本中, FTA-ABS验证结果有26份样本IgM和 IgG抗体均为阴性。卫生部临床检验中心WANG等[33] 的研究表明, InTec ELISA和TPPA检测无偿献血者抗TP抗体呈阳性反应的结果(均经双孔复检)与WB确证试验检测抗TP抗体的符合率分别为80.1%和76.0%, 即InTec ELISA和TPPA检测抗TP抗体的假阳性率分别高达19.9%和24.0%。
2.导致ELISA和CLIA抗TP抗体筛查试验假阳性的原因
导致间接ELISA和CLIA检测抗TP抗体假阳性的原因与间接ELISA和CLIA检测抗HCV抗体假阳性类似, 自身免疫病、HIV感染、孕期妇女、静脉药瘾者中均有可能出现抗TP抗体假阳性结果; 近年市售的双抗原夹心ELISA检测抗TP抗体出现假阳性的因素还与密螺旋体属中的其他非梅毒(苍白)螺旋体物种有关。人体内存在一些不致病或可能参与齿龈类、牙周病、腹泻等发病的与人类共生的螺旋体含有某些与TP相同的抗原决定簇, 可使宿主产生抗TP某些抗原组分的抗体, 经典的程序是检测前须增加一前处理步骤, 即用非致病性密螺旋体(treponema phagedenis)的Reiter株提取物吸收血清中可能存在的与其他非梅毒螺旋体抗原产生交叉反应的抗群、抗属或抗科抗体, 而目前市售试剂均省略了该过程, 从而增加了假阳性的概率; 在使用基因工程方法制备的重组多肽抗原代替以往使用的野生型TP抗原后, 由于抗原纯度高, 理论上提高了试验的敏感性和特异性, 但在双抗原夹心法测定 TP中, 基因工程混合多肽抗原 Tpn17(MW 17 000)和 Tpn47(MW 47 000)常用来包被微孔和酶标记物, 为使小分子多肽较好地吸附在微孔上, 常使用人血清白蛋白作为桥联接, 可能受试血清中有针对人血清白蛋白抗原位点产生的抗体等干扰物质而造成抗 TP抗体假阳性的可能。此外, 在孕产妇、肿瘤患者以及老年人中抗TP抗体筛查试验假阳性的现象尤甚。武艳霞等[34]发现, 由妊娠引起的孕产妇血清抗TP抗体假阳性还可累及新生儿血清抗TP抗体假阳性, 并证实这类假阳性经一定时间可以阴转。陈红霞[35]报道, 肿瘤患者和老年患者的抗TP抗体假阳性率均高于一般人群。孕产妇及新生儿抗TP抗体假阳性可能是甲胎蛋白形成二聚体在ELISA检测中对反应板的吸附作用而产生假的显色反应; 而肿瘤患者或老年患者所患的基础疾病可能使机体释放可诱导产生抗TP抗体的交叉抗原, 或有较大可能存在针对连接用的白蛋白的抗体。
3.国内实验室在提高ELISA和CLIA抗TP抗体筛查试验阳性预测值方面的尝试
熊继红等[37]发现, Abbott i2000免疫分析仪检测抗TP抗体结果的真阳性率(阳性预测值)与S/CO比值呈正相关, 当S/CO比值在1~2之间时, 真阳性率仅为19.3%; S/CO比值在 7~10之间时, 真阳性率可达97.5%。朱鸿等[38]报道, 在Abbott i2000化学发光仪及配套抗TP抗体检测呈阳性反应(S/CO比值≥ 1)的98份样本中, 21份为假阳性, 若将cut off值提高至S/CO比值为5.19, 则检测结果的阳性预测值可提高至94.8%。王伦善等[39]的研究表明, 抗TP抗体ELISA的S/CO比值的高低与真阳性率呈正相关, 此研究以无偿献血者为研究对象, 国产万泰和丽珠ELISA试剂检测抗TP抗体均有一定的假阳性率, 当S/CO比值分别为1.68和1.85时, 阳性预测值可分别达到98.3%和96.5%。
与抗HCV检测类似, 在低流行率人群中, 抗TP抗体筛查试验假阳性率较高, 而在高流行率人群中, 假阳性率相对较低。
三、正确选用TP感染临床检测的筛查试验和确证试验
NTrAT以心磷脂、胆固醇和磷脂酰胆碱等为抗原检测非特异性的抗心磷脂抗体(反应素), 存在生物学假阳性, 故不推荐以RPR或TRUST作为血清学筛查试验。
美国CDC曾于2002 年在《 疾病率和死亡率周报建议和报告》中建议将TPPA作为血清特异性抗TP抗体检测方法之一(另一方法为FTA-ABS), 在相当长的一段时间内, 国内很多研究报告将TPPA作为抗TP抗体检测的“ 确证” 试验(相对于NTrAT的RPR和TRUST), 其中存在一定的误区。近年来不断积累的资料表明, TPPA检测抗TP抗体存在一定比例的假阳性。方伟祯等[40]报道, 在263例TPPA阳性的受检者中仅有192例可确诊为TP感染, 其余71例为非梅毒患者, TPPA的假阳性率为27%, 不可小觑, 因而不适宜选作确证试验。近年有人提出梅毒血清学试验的逆向筛查策略[39], 即是将筛查流程从既往以NTrAT(RPR或TRUST)作为筛查试验, 筛选有反应性的样本继行TrAT(如TPPA), 改为将TrAT(如ELISA)作为筛查试验, 筛选有反应性的样本继行NTrAT(RPR或TRUST), 对2种方法不一致的样本再用WB确认。这一策略虽可避免由NTrAT导致的较高的生物学假阳性, 但由于NTrAT是一类非特异性试验, 可用其复检(但由于抗心磷脂抗体在血循环中出现晚于抗TP抗体, 且晚期梅毒可能转阴, 故NTrAT不适于一期梅毒的早期和三期梅毒检测)或考核疗效, RPR或TRUST阳性可作为现症梅毒的依据之一, 但绝不应将其视作确证试验。
综上所述, 抗TP抗体的筛查试验可选TrAT 的ELISA、CLIA和TPPA等, 而确证试验以WB为首选, 有条件也可进行病原体检测, 包括暗视野显微镜法、镀银染色法和核酸检测, 但前2种方法较为繁琐, 不适于实验室常规检测, 而TP的核酸测定在早期梅毒的诊断中有独特的优势[40]。通常不推荐采用FTA-ABS作为确证试验, 但在非常专业的实验室, 确证试验的检测量非常大, 在保证试剂质量和良好重复性的前提下, 可采用FTA-ABS确认。
四、TP感染试验诊断程序(建议)的建立及结果报告和解释
TP感染实验诊断程序尚未形成成熟的指南, 部分参照HCV感染试验诊断指南, 我们建议采用以下程序:
(1) 由于ELISA和CLIA检测抗TP抗体结果的真阳性率(阳性预测值)与S/CO比值呈正相关[37, 38, 39], 抗TP抗体筛查试验在低流行率人群中假阳性率高于高流行率人群[41], 实验室在应用上述初筛试剂之前, 应通过试验确定在特定人群中该初筛试剂呈阳性反应结果的阳性预测值≥ 95%的S/CO比值, 以此作为S/CO高比值与低比值的区分界限。
(2)经TrAT中的TPPA、ELISA或CLIA检测抗TP抗体初筛试验结果阴性的样本可直接报告为抗TP抗体阴性, 即未感染TP, 但也可能处于TP感染的窗口期(约2~4周)。
(3)对于初筛试验呈阳性反应的样本, 均应采用另一种方法(原理)的TrAT筛查试验重复检测, 若仍呈阳性反应, 则样本可判定为抗TP抗体初筛试验呈阳性反应; 但在未经按下述(4)中所列标准作出判断是否应进行确证试验之前不应报告抗TP抗体结果。
(4)基于ELISA或CLIA初筛试验的S/CO比值对初筛试验呈阳性反应的样本应作不同处理, 初筛试验S/CO高比值的样本, 可报告抗TP抗体结果为阳性(但须同时注明只能预测95%的确认阳性, 仍存在< 5%的假阳性)而不必进行确证试验(除非送检者有要求); 初筛试验呈阳性反应的S/CO低比值的样本, 应进行更特异的补充试验予以确认。
(5)确证试验首选WB, 根据确证试验结果出具报告。WB结果报告抗TP抗体阳性、不确定或阴性, 对其中抗TP抗体不确定的受检者, 需要收集另一份样本(> 1个月)进行WB或用NAT 检测TP DNA予以确认。若NAT和WB 确证试验结果均为阴性, 则报告TP DNA和抗TP抗体均阴性(即可证实初筛试验结果为假阳性), 提示未感染TP; NAT确证试验阴性而WB再次确证试验结果为阳性, 则报告抗TP抗体阳性, TP DNA阴性, 提示既往有TP感染, 已得到治疗(也可补测NTrAT中的RPR或TRUST, 若同时阴性, 可进一步证实已治愈); TP DNA阳性而抗TP抗体阴性的结果提示试验有误差, 不应报告结果, 应予复检。
(6)由于NTrAT中RPR或TRUST检测的是抗心磷脂抗体, 其在血循环中出现晚于抗TP抗体, 且晚期梅毒可能转阴, 故NTrAT不适于一期梅毒的早期和三期梅毒检测。RPR或TRUST可用于对有临床症状的高风险患者进行早期梅毒的快速检测, 同时采用TrAT(ELISA、CLIA或TPPA)作为补充试验。此时进行RPR、TRUST检测时, 需对血清样本进行原倍以及稀释检测, 以避免前带现象导致的假阴性结果。RPR或TRUST阳性可作为现症梅毒的依据之一; 对于经确证试验确认为阳性的梅毒患者, 可用 RPR、TRUST进行血清学的定量检测来判定疾病的活动性和考核梅毒治疗效果(以6个月RPR或TRUST滴度下降4倍为治疗有效, 一期梅毒治疗1年、二期梅毒治疗2年检测RPR或TRUST转阴且2年内未再次阳转可判断为梅毒治愈)。
(7)如怀疑一期梅毒, 可进行特异性TP IgM血清学试验, 如有必要, 可在1~2周后重复检测; 若确证试验结果为阳性且有临床症状的NTrAT阴性患者, 应进行特异性的密螺旋体IgM检测, 如密螺旋体IgM阳性, 则提示活动性感染; 密螺旋体IgM阴性, 特别是患者处于TP感染的晚期时, 不能排除活动性感染。
