原理
微管蛋白溶液在0~4℃是无色透明溶液，当温度升高，或37℃保温时，管蛋白聚合生成微管，随之溶液的浊度增加，吸收度（OD）上升，这可用分光光度计，在 350 nm 波长测得，根据所测得的OD值对保温时间作图，绘出“S”型聚合曲线。相反，将已聚合的微管溶液放水浴。亦可以测定其解聚曲线。
材料与仪器
动物脑组织
MES EGTA MgCl2 Glycerin DMSO
水浴锅 离心机 分光光度计
MES EGTA MgCl2 Glycerin DMSO
水浴锅 离心机 分光光度计
步骤
一、 微管蛋白的制备
1. 试剂及贮备液
（1）MES贮备液（2N（-Morpholino）ethanesulfonic acid）0.5 mol，MES 19.25 g溶于200 ml 双蒸馏水。
（2）EGTA贮备液[Ethylene-bis（oxyethylenenitrile）] tetraacetic acid] 5 mmol，EGTA 90 mg溶于100 ml 双蒸馏水，可以用少量1 mol/L NaOH溶液使其完全溶解。
（3）MgCl2贮备液0.1 mol/L。
2. 缓冲液配制
（1）MES缓冲液：用1 mol/L NaOH调pH至6.5，加双蒸水至400 mL。放4℃保存备用，临用前加GTP或ATP至1 mmol。
（2）微管聚合缓冲液：用1 mol/L NaOH调pH至6.5，加双蒸水至50 mL。放4℃保存备用，临用前加GTP或ATP至1 mmol。
1. 试剂及贮备液
（1）MES贮备液（2N（-Morpholino）ethanesulfonic acid）0.5 mol，MES 19.25 g溶于200 ml 双蒸馏水。
（2）EGTA贮备液[Ethylene-bis（oxyethylenenitrile）] tetraacetic acid] 5 mmol，EGTA 90 mg溶于100 ml 双蒸馏水，可以用少量1 mol/L NaOH溶液使其完全溶解。
（3）MgCl2贮备液0.1 mol/L。
2. 缓冲液配制
（1）MES缓冲液：用1 mol/L NaOH调pH至6.5，加双蒸水至400 mL。放4℃保存备用，临用前加GTP或ATP至1 mmol。
（2）微管聚合缓冲液：用1 mol/L NaOH调pH至6.5，加双蒸水至50 mL。放4℃保存备用，临用前加GTP或ATP至1 mmol。
3. 取材
微管在其核细胞普遍存在，但以动物脑组织中含量最丰富。一般取猪脑，牛脑，因其来源方便，价格便宜。也有用兔、鸡、大鼠的脑组织以及海胆卵为材料。
微管在其核细胞普遍存在，但以动物脑组织中含量最丰富。一般取猪脑，牛脑，因其来源方便，价格便宜。也有用兔、鸡、大鼠的脑组织以及海胆卵为材料。
4. 操作
（1）取新鲜动物脑组织，剥去脑膜和大血管，剪碎。
（2）用冷MES缓冲液洗1-2次。
（3）以每克脑组织0.5~1 mL 比例，加入MES缓冲液，在4℃条件下，用带有Teflon碾槌的电动 （或手动）玻璃匀浆器制成匀浆。
（4）4℃离心105 000 g，1 h，取上清。
（5）加入等体积微管聚合缓冲液，置37℃水浴保温30 min（同时振摇或中途轻轻搅动数次）。
（6）26℃离心，105 000 g，1 h。
（7）取沉淀，加1/10匀浆体积的冷MES缓冲液，轻轻搅拌或用匀浆器将沉淀研碎。
（8）将悬液放冰 0.5 h，使沉淀完全溶解。再重复低温和高温离心各一次。
（9）经过这样两个循环制得的微管蛋白 85%~95%，其余为微管相关蛋白。
（10）测定蛋白含量。用MES缓冲液稀释至4~5 mg/mL，置液氮中保存备用或再进一步纯化。
（1）取新鲜动物脑组织，剥去脑膜和大血管，剪碎。
（2）用冷MES缓冲液洗1-2次。
（3）以每克脑组织0.5~1 mL 比例，加入MES缓冲液，在4℃条件下，用带有Teflon碾槌的电动 （或手动）玻璃匀浆器制成匀浆。
（4）4℃离心105 000 g，1 h，取上清。
（5）加入等体积微管聚合缓冲液，置37℃水浴保温30 min（同时振摇或中途轻轻搅动数次）。
（6）26℃离心，105 000 g，1 h。
（7）取沉淀，加1/10匀浆体积的冷MES缓冲液，轻轻搅拌或用匀浆器将沉淀研碎。
（8）将悬液放冰 0.5 h，使沉淀完全溶解。再重复低温和高温离心各一次。
（9）经过这样两个循环制得的微管蛋白 85%~95%，其余为微管相关蛋白。
（10）测定蛋白含量。用MES缓冲液稀释至4~5 mg/mL，置液氮中保存备用或再进一步纯化。
二、微光蛋白活性的测定
1. MES缓冲液，配制方法同上。
2. ATP（或GTP）溶液100 mmol/L的原液，试验当天配制，试验前加入到微管溶液， 终浓度为1 mmol/L。
（1）取出冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲其瓶壁，使之融化。
（2）放入冰浴，用MES缓冲液稀释到所需要浓度（2~3 mg/ml），加入ATP至1 mmol/L。
（3）从冰浴上马上取出的微管蛋白溶液在分光光度计350 nm 下调定为“0”点。
（4）然后将比色用37℃水保温，于不同时间，测其OD 值。
（5）在开始时最好每1~2 min 测定一次，5 min 以后可间隔较长些时间测定。
（6）直到20~30 min止，将比色杯放冰浴，这时已聚合的微管又解聚，可随时测定其OD值，直到OD值不再下降为止。
（2）放入冰浴，用MES缓冲液稀释到所需要浓度（2~3 mg/ml），加入ATP至1 mmol/L。
（3）从冰浴上马上取出的微管蛋白溶液在分光光度计350 nm 下调定为“0”点。
（4）然后将比色用37℃水保温，于不同时间，测其OD 值。
（5）在开始时最好每1~2 min 测定一次，5 min 以后可间隔较长些时间测定。
（6）直到20~30 min止，将比色杯放冰浴，这时已聚合的微管又解聚，可随时测定其OD值，直到OD值不再下降为止。
（7）以所测得的OD值对保温时间作图可以得到一个正“S”型的聚合曲线，和倒“S”型解聚 曲线（图65-4）可看到，37℃保温开始1~2 min，是一暂短的潜伏期，然后曲线呈指数上升。
（8）5 min 后达坪值。当将温度变为0℃时，曲线迅速下降，但解聚曲线末端比起始端的位置稍高, 可能与聚合时形成的少量不能解聚的聚集物有关。
（9）这种聚合曲线表明微管蛋白有较好的活性，而坪值的高低与管蛋白浓度高低成正比（图65-5）。
（10）上述测定方法如在连有髙低温水浴和自 动扫描记录仪的分光光度计上完成，就更简便，快速，准确。
（8）5 min 后达坪值。当将温度变为0℃时，曲线迅速下降，但解聚曲线末端比起始端的位置稍高, 可能与聚合时形成的少量不能解聚的聚集物有关。
（9）这种聚合曲线表明微管蛋白有较好的活性，而坪值的高低与管蛋白浓度高低成正比（图65-5）。
（10）上述测定方法如在连有髙低温水浴和自 动扫描记录仪的分光光度计上完成，就更简便，快速，准确。
三、 抗微管药物的筛选
1. 具体操作
（1）药物或化合物能溶于水的，用MES缓冲液配成10 mmol/L 的溶液，如不溶于水的可用乙醇、甲醇、DMSO溶解，放冰箱备用。
（1）药物或化合物能溶于水的，用MES缓冲液配成10 mmol/L 的溶液，如不溶于水的可用乙醇、甲醇、DMSO溶解，放冰箱备用。
（2）一般从0.1 mmol/L 浓度开始测定药物对微管的影响的实验，如发现有明显的作用，可以进一步稀释3~5个浓度进行测量。
（3）如果0.1 mmol/L 时没有看到明显作用，则认为该药对微管作用不强，不必作进一步的测定。
（3）如果0.1 mmol/L 时没有看到明显作用，则认为该药对微管作用不强，不必作进一步的测定。
（4）具体试验方法，步骤同前（微管蛋白聚合活性的测定）。
2. 结果判断及计算
2. 结果判断及计算
（1）抑制微管聚合作用的药物举例：秋水仙碱（图65-6）。抑制率计箅，取37℃保温 20 min 时，各管的“OD”按以下公式计箅:
（2）促进聚合，抑制解聚的药物举例：紫杉醇（图65-7）。由图65-7看出，加药后。
①潜伏期缩短，甚至消失。
②聚合曲线的形状较对照有明显改变。
③在改变温度至0-4冗时，微管不能完全解聚。
由以上变化不难判定该药对微管有明显的影响。
①潜伏期缩短，甚至消失。
②聚合曲线的形状较对照有明显改变。
③在改变温度至0-4冗时，微管不能完全解聚。
由以上变化不难判定该药对微管有明显的影响。
注意事项
1. 在制备微管蛋白的实验中，一定注意取材要新鲜，争取在处死动物后1 h 内开始实验。不能用低温冷冻后的脑组织，否则收率不高，活性低。
2. 所有器皿要清洁，避免钙离子污染。
3. 组织匀浆过程中，尽量避免过多泡沫产生，减少蛋白变性。
4. pH对微管体外聚合影响较大，在药物筛选时，注意药液的pH不能过高或太低，尽量使加入药液后，微管蛋白溶液pH不发生明显改变。
5. 取冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲洗瓶壁，使融化，放入冰浴，用冷MES缓冲液（不含GTP或 ATP）稀释至所需浓度（2~3 mg/ml），加入GTP 或 ATP至1.0 mmol/L 。
6. 以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度350 nm 处调定为“0点。
7. 比色杯在37℃中保温，取不同时间测OD值。（每1~2 min 测定一次，5 min 后可延长测定间隔），直至20~30 min 为止。
8. 比色杯放入冰浴中，可随时测定其OD值，直至OD值不再下降。
常见问题
1. 抗微管类药物是通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成，并抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。通过作用于细胞微管而影响纺锤体形成，并抑制细胞有丝分裂的一类广谱化疗药。目前常用的抗微管类药物主要有：紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱和长春瑞滨等。
2. 紫杉醇/多西他赛作用于肿瘤细胞后，可以促进肿瘤细胞内的微管聚合以及稳定已聚合的微管，导致细胞内大量微管聚集，进而干扰细胞各种功能，特别是使细胞停止分裂。长春碱/长春新碱等可以抑制肿瘤细胞内微管蛋白的聚合、抑制纺锤体微管的形成，使核分裂停滞于细胞分裂中期，从而抑制肿瘤细胞生长。
来源：丁香实验
