抗微管药物实验方法(不是很复杂,不防一试）
丁香园
864
一、 试剂制备
MES缓冲液 250ml
MES 0.1mol/L 4.88g
EGTA 1.0mmol/L 95.09mg
Mgcl2 0.5mmol/L 25.41mg
PH 6.5
临用前加GTP or ATP 1.0mmol/L
4℃保存
微管聚合缓冲液 250ml
MES 0.1mol/L 4.88g
EGTA 1.0mmol/L 95.09mg
Mgcl2 0.5mmol/L 25.41mg
Glycerin 8mmol/L 184.18mg
PH 6.5
临用前加GTP or ATP 1.0mmol/L
4℃保存
二、微管蛋白制备
1） 取动物脑组织，剥离脑膜和大血管，切碎。
2） 用冷MES缓冲液洗涤2次（每克脑组织加MES缓冲液0.5－1.0ml）, 4℃条件下制成匀浆
3） 4℃，105000g离心1h，取上清，加入等体积微管聚合缓冲液，37℃水浴30min(中途轻轻搅动数次)
4） 26℃，105000g离心1h，取沉淀，加入约0.1体积的冷MES缓冲液，轻轻搅动，悬液冰浴30min，使沉淀完全溶解。
5） 重复3、4步骤，得微管蛋白。
6） 用Lowry’s法测定蛋白含量，用MES缓冲液稀释到4－5mg/ml，液氮保存 or 进一步纯化。
三、抗微管药物的筛选
1） 水溶性药物用MES缓冲液配成10mmol/L溶液，水不溶性药物可用DMSO溶解，冷藏备用。
2） 从0.1mmol/L开始测定微管蛋白聚合活性（步骤如下），如用明显作用，稀释后测量：如0.1mmol/L作用不明显，无进一步测定价值。
3） 微管蛋白聚合活性测定
a． 取冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲洗瓶壁，使融化，放入冰浴，用冷MES缓冲液（不含GTP or ATP）稀释至所需浓度（2－3mg/ml）,加入GTP or ATP至1.0mmol/L
b． 以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度350nm处调定为“0”点。
c． 比色杯在37℃中保温，取不同时间测OD值。（每1－2min测定一次，5min后可延长测定间隔），直至20－30min为止。
d． 比色杯放入冰浴中，可随时测定其OD值，直至OD值不再下降。
MES缓冲液 250ml
MES 0.1mol/L 4.88g
EGTA 1.0mmol/L 95.09mg
Mgcl2 0.5mmol/L 25.41mg
PH 6.5
临用前加GTP or ATP 1.0mmol/L
4℃保存
微管聚合缓冲液 250ml
MES 0.1mol/L 4.88g
EGTA 1.0mmol/L 95.09mg
Mgcl2 0.5mmol/L 25.41mg
Glycerin 8mmol/L 184.18mg
PH 6.5
临用前加GTP or ATP 1.0mmol/L
4℃保存
二、微管蛋白制备
1） 取动物脑组织，剥离脑膜和大血管，切碎。
2） 用冷MES缓冲液洗涤2次（每克脑组织加MES缓冲液0.5－1.0ml）, 4℃条件下制成匀浆
3） 4℃，105000g离心1h，取上清，加入等体积微管聚合缓冲液，37℃水浴30min(中途轻轻搅动数次)
4） 26℃，105000g离心1h，取沉淀，加入约0.1体积的冷MES缓冲液，轻轻搅动，悬液冰浴30min，使沉淀完全溶解。
5） 重复3、4步骤，得微管蛋白。
6） 用Lowry’s法测定蛋白含量，用MES缓冲液稀释到4－5mg/ml，液氮保存 or 进一步纯化。
三、抗微管药物的筛选
1） 水溶性药物用MES缓冲液配成10mmol/L溶液，水不溶性药物可用DMSO溶解，冷藏备用。
2） 从0.1mmol/L开始测定微管蛋白聚合活性（步骤如下），如用明显作用，稀释后测量：如0.1mmol/L作用不明显，无进一步测定价值。
3） 微管蛋白聚合活性测定
a． 取冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲洗瓶壁，使融化，放入冰浴，用冷MES缓冲液（不含GTP or ATP）稀释至所需浓度（2－3mg/ml）,加入GTP or ATP至1.0mmol/L
b． 以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度350nm处调定为“0”点。
c． 比色杯在37℃中保温，取不同时间测OD值。（每1－2min测定一次，5min后可延长测定间隔），直至20－30min为止。
d． 比色杯放入冰浴中，可随时测定其OD值，直至OD值不再下降。
