ELISA一步法误判高浓度抗-HIV为阴性1例

徐树良 孙启俊 马成平 马贵明 谈维 柯苑 南京红十字血液中心 210008

关键词：抗-HIV/假阴性 ELISA Hook effect

酶联免疫吸附试验（ELISA）以其简便、快速、灵敏、特异性好，且适用于大批标本检测之特点，而广泛地应用于诸多领域，也是目前采供血机构筛查献血者各类传染性指标的主要检测方法。ELISA抗-HIV就其操作步骤来分有两类：即“一步法”与“二步法”，前者相对于后者，少一个洗板和加酶标记物再孵育的步骤，因此操作更为简便，为广大用户所青睐，国内有不少厂家在生产这类抗-HIV试剂盒。笔者在献血者血液标本的日常初、复检中，使用了二类各1家试剂，发现1例标本明显的一阴一阳结果，后经稀释法、二类多家试剂、抗-HIV确认试验，证实为ELISA“一步法”引起的假阴性结果，报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本采自本血液中心无偿献血者，采全血200ml于ACD-B三联袋T－200ml（上海市血液中心生产，批号0301406-14）内，并分离新鲜血浆135ml。
1.2 试剂 抗-HIV ELISA试剂盒（厦门新创公司，批号2003046603；上海科华公司，批号20030228；北京金豪公司，批号20030328；吉比爱公司，批号20030316；北京万泰公司，批号20030505；河南理利公司，批号20030421）均为抗-HIV1+2双抗原夹心法且通过国家批批检。“一步法”试剂分别以A、B、C表示；“二步法”以D、E、F表示。确认试剂（WB）Genelabs HIV BLOT2.2 Batch：AE3004 EXP：01.OCT.2004。
1.3 主要仪器 ML/AT-plus2全自动加样仪和用户软件（瑞士）；FM全自动酶免疫分析仪（瑞士）；Anthos-AW I洗板机；Anthos-Ⅲ酶标仪（奥地利）。
1.4 方法 血标本在常规用两类各1家试剂进行抗-HIV初、复检时，发现D试剂呈阳性反应（s/co>24）；而A试剂则为阴性（s/co<0.4）。把该份血标本以生理盐水作原倍（不稀释）、1.5倍及2n倍比稀释后测定。并再用国产其他两类多家抗-HIV ELISA试剂同时作每一稀释度双孔检测，操作严格按各试剂说明书进行。

2 结果

2.1 二类6种ELISA抗-HIV试剂对该份血标本的检测结果见图1。
2.2 HIV抗体确认结果 该例经江苏省艾滋病检测确认中心以免疫印迹法（WB）确认为HIV-1抗体阳性，带型为gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p39 p31 p24 p17阳性。

3 讨论

从实验结果中可以很明显地看出，有些试剂在这1例血标本的检测中出现了假阴性结果，而将标本通过适当稀释后阳性复现，这是一种“HOOK”效应（Hook effect），即在检测高滴度抗原（抗体）时出现的极低水平阳性和假阴性结果。产生“Hook effect”的原因，多数研究认为，是由于在检测高滴度抗原（抗体）时，抗原（抗体）与固相抗体（抗原）反应的比例不当，过剩的抗原（抗体）仅与标记抗体（抗原）结合，而不能与固相抗体（抗原）吸附，洗涤时被洗掉，从而导致仅有少量标记抗体（抗原）被利用，造成低的计数或假阴性结果[1，2]。也就是说，出现“Hook effect”是标本中的抗原（抗体）浓度太高而引起（本例标本稀释至216还呈阳性反应）。要改善“Hook effect”，最简单的方法是稀释高滴度的待测标本，这无疑将增加工作量，更重要的是因“Hook effect”带来的假阴性结果将给献血者筛选、血液及血液制品的质量检测工作带来严重后果。从笔者的实验结果还可以看出，“一步法”的试剂都出现“Hook effect”；而“二步法”都能以高OD值检出阳性，这与文献报道的“一步法”易出现“Hook effect”的观点一致。分析原因“一步法”是把待测标本与酶标记抗原（抗体）同时加入微孔板内孵育，这样当待测标本中的抗体浓度很高时，极易造成与液相中的酶标记抗原（抗体）产生浓度竞争性优先结合，而不与固相微孔板上的抗原结合（一般用以包被酶标板的抗原浓度很低，只有几十μg/ml），结果被洗涤时清洗掉了，而“二步法”一般在加待测标本前，要加一定的稀释液，这实际上就起到了稀释标本的作用，并且在步骤上，让待测标本先与固相微孔板作用第一孵育时间，然后洗板再加酶标记物，这就从客观上消除了浓度竞争优先效应。有文献报道，采用“二步法”检测HBsAg可完全消除“Hook effect” [3]。因此笔者认为，虽然ELISA抗-HIV“一步法”操作更为简捷，但应警惕其产生的“Hook effect”，特别是对于采供血机构在对献血者标本的初、复检中，在选择两家不同试剂时，应当考虑，不能选择同一类型的“一步法”试剂。以避免“Hook effect”导致的严重后果。

参考文献

1 Perera P, Worwood M. Antugen binding in the two-site immunoradiometric assay for serum ferritin; the nature of the hook effect. Ann Clin Biochem, 1984, 21(5):393
2 Ch’ng SL, How VJ, Soon KF, et al. Dissociation of hepatitis B surface B antigen (HBsAg) from immobilised anti-HBsAg anti-body in a two site immunoradiometric assay: its relevance to hook effect and recycled assay. J Immunoassay 1987, 8(2-3):237
3 张春英，冯百芳，殷珊，等. “一步法”检测HBsAg的“Hook”效应.中国输血杂志，1994，7（4）：188

来源：检验世界网