一步法

（1）0.5 μl 100 μmol/l 正向引物（终浓度0.5 μmol/l）

（2）0.5 μl 100 μmol/l 反向引物（终浓度0.5 μmol/l）

（3）6 μl 3 mmol/l 4dNTP混合物（终浓度0.12 mmol/l）

（4）2 μl 10 mmol/l MnCl₂（终浓度0.2 mmol/l）

（5）10 μl 25 mmol/l MgCl₂（终浓度2.5 mmol/l）

（6）2 μl 10×rTth 转录缓冲液（终浓度0.2×）

（7）8 μl 10×螯合缓冲液（终浓度0.8×）

（8）10 μl 1.7 mg/ml BSA（终浓度0.17 mg/ml）

（9）2 μl 2.5 U/ml rTth DNA聚合酶（终浓度9.05 U/ml）

（10）29 μl DEPC处理过的水
 

3.  用20 μl 吸头加8 μl（如用3孔载玻片）或12~20 μl （如用单孔载玻片）原位PCR扩增体系于各孔上，该液体覆盖整个孔表面。

4.  放20 mm×60 mm 盖玻片于每一载玻片上，小心用指甲油封住盖玻片边缘。

 

5.  在92℃加热块上，温育玻片90 s。然后转至热循环仪。

6.  用步骤2所配一步反应体系代替原位PCR反应体系。

7.  按如下温度循环程序进行反转录：

（1）1个循环：15 min，70℃

（2）3 min，92℃

（3）15 min，70℃

（4）3 min，92℃

（5）15 min，70℃

8.  按如下温度循环程序进行原位PCR：

（1）29个循环：1 min，93℃（变性）

（2）1 min，53℃（退火）

（3）1 min，72℃（延伸）

（4）最后一步：不定，4℃（维持）

9.  由热循环仪上取下载玻片，浸于100%乙醇中≥5 min 溶解指甲油，用剃须刀或其他小刀橇开盖玻片，刮去残留的指甲油，以便在杂交/检测步骤中能平放上新的盖玻片。

10.  在92℃加热块上温育玻片1 min，然后于室温下用2×SSC浸泡5 min。玻片在4℃可存敢2~3周。