一步法RT_PCR详细步骤（原创）

1．材料和方法

Access RT-PCR System 试剂盒 (A1250)：Promega 公司产品。

500u AMV Rev 目的基因 se Transcriptase, 5u/ul

500u Tfl DNA Polym 目的基因 ase, 5u/ul

1 ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff 目的基因

1.25 ml MgSO4, 25 mM

100ul dNTP Mixture, 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP

50ul Positive Control RNA with Carri 目的基因 (1.25 attomole/ul)

100ul Upstream Control Prim 目的基因, 15ulM

100ul Downstream Control Prim 目的基因, 15uM

13 ml Nuclease-Free Wat 目的基因

1.2　方法

总 RNA 提取

具体步骤：

1) 称取各组的大鼠肺组织标本 50-100 mg，用剪刀将组织块剪成若干碎块 (须避免 RNA 酶的污染)。

2) 将组织碎块加入 1 mlTripure 中 (所加组织块的体积不能超过 Tripure 体积的 10%)，在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止，研磨过程在 0℃ 冰水中进行，以防止组织 RNA 被降解。

3) 然后将组织匀浆液转移到 1.5 ml 的 Eppendorf 管中，15℃-25℃ 的环境中孵育匀浆 5 min，使核蛋白复合体完全分离。

4) 加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧盖子，放在震荡器中剧烈震荡 15 秒左右，15℃-25℃ 的环境中孵育 2 min-15 min。

5) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (12000 g/min，15 min)。此时可见液体分层：底层——红色酚氯仿相；中间层——界面相；上层——无色液相。

6) RNA 仅存于上清中。将上清转移至新管中 (切勿将中间层误吸入)，

7) 加入 0.5 ml 的异丙醇，充分混匀，室温 5 min-15 min。

8) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (12000 g/min，10 min)。

9) 弃上清 (动作轻，慢)，在管底部可见一乳白色小沉淀物，即为 RNA。

10) 加入 1 ml75% 乙醇，混合震荡，（可在 2℃-8℃ 中保存一周，－15－25℃ 中保存一年）

11) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (7500 g/min)5 min 弃上清，

12) 通风，室温中干燥 5 min-10 min，让乙醇挥发（根据肉眼观察管内水分情况，不能太干，RNA 干后难溶解）。

13) 加入 30ul-50ul 的 0.1% 的 DEPC，吹打数次，

14) 55－60℃ 孵育 10 min，冰上冷却，

15) 供下一步实验使用或-70℃ 冻存。

RNA 完整性的检测

1) 制备琼脂糖凝胶，称取琼脂糖凝胶 0.34 g，加入 0.5×TBE 缓冲液 20 ml，微波炉加热至熔化。

2) 最后配成终浓度为 1.7% 琼脂糖凝胶液体。

3) 加入溴乙啶 (0.5 mg/ml)2ul，混匀。

4) 冷却至室温。

5) 在水平电泳槽上制胶，凝固后浸入 0.5×TBE 缓冲液中，除去样本梳。

6) 取 1ugRNA 与 1.5ul 甲醛、4.5ul 甲酰胺混合， 60℃ 水浴 10 min，加入 1ul 上样缓冲液 (0.25% 溴酚蓝；40% 蔗糖)，75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 处。

RNA 的纯度和浓度检测

1) 预热 GeneQuant 并调制好各项参数，

2) 用灭活的 DEPC 水 1000ul 调零。

3) 取 RNA 样品 1ul，加入灭活的 DEPC 水 1000 ul，混匀。

4) 直接读取 RNA 浓度和 Ratio，并根据稀释情况得出实际的 RNA 浓度，重复操作三次取平均值。

5) RNA 的 Ratio 均在 1.7-2.0 之间。RNA 浓度在 0.5ug/ul-1ug/ul，分装 10ul 一管，于-70℃ 冰箱中冻存。

RT-PCR

（一）引物的配制：

1. 将所合成的目的基因和 GAPDH 上下游引物 (1OD) 用 0.1% DEPC 水溶解。

2. 根据各个引物分子量的不同，计算加 0.1%DEPC 水的量。

3. 目的基因和 GAPDH 上下游引物所加的 0.1% DEPC 水量分别为：488ul，431ul，ul，ul 使其终浓度均为 20pmol/ul。

4. 于-20℃ 冰箱中冻存，备用。

RT－PCR 反应体系 (25ul)：

无酶水　　　　　　　　　　　　 14.4ul

AMV Buff 目的基因　　　　　　　 5ul

dNTP　　　　　　　　　　　　 0.5ul

目的基因上游引物 0.75ul

目的基因下游引物 0.75ul

GAPDH 上游引物 0.75ul

GAPDH 下游引物 0.75ul

MgSO4 0.8ul

Tfl DNA Poly 0.5ul

RNA 0.8ul

将上述各成分混匀并覆盖石蜡油 20 ul，标注号码后放入基因扩增仪内。

RT-PCR 扩增的条件与参数：48℃，45 min，94℃，2 min； 94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2 min 共 40 个循环；循环完毕后 68℃ 延伸 7 min。扩增产物进行电泳或-20uC 冻存。

RT-PCR 产物分析：

（一）RT-PCR 产物电泳分析

1. 取 6 ul RT-PCR 产物与 1ul 上样缓冲液混合后上样于 2% 琼脂糖凝胶，同时以 0.8ul Ladd 目的基因点样，以 0.5×TBE 为缓冲液电泳。

2. 75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析。

3. 图像分析处理系统进行辉度扫描，并以 GAPDH 校正作相对量分析，数值以两者之积分吸光度的比值表示。

PCR 产物测序：

扩增好的目的基因的 PCR 产物 (50ul) 进行测序。

我的试验计划，请多提意见，谢谢。