【原创】PCR

一、原理：

(1) PCR特点：

扩增片段大小由2条引物与模板的结合位点决定；经过PCR扩增，产物以指数级数增加，达到目的片段的大量扩增。

(2) Taq DNA聚合酶简化并推动了PCR的发展：

水生栖热菌（Thermus aquaticus）,75OC温泉

半衰期：95OC 38分钟

最适温度：72OC，耐高温特性使PCR反应的特异性增加。

(3) 各种来源的DNA都可以作为PCR扩增的模板

DNA
mRNA cDNA
cDNA文库或DNA文库
细胞直接煮沸

(4) PCR的特异性、效率和忠实性

PCR成分的影响

PCR循环的影响

DNA聚合酶的影响

(二) 人工合成: 如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出为该多肽链编码的核苷酸序列，利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。

(三) 基因文库 (gene library) ：应用核酸的分离纯化技术把生物体全部DNA提取出来，用限制性内切酶随机切成长短大致相同的数以万计的片段，所有片段均重组入同一类载体（质粒或噬菌体），得到许多重组体，全部转化入宿主菌中保存起来。

它含有全部基因的信息，称为基因文库。用基因组的总DNA制备的称为基因组文库；用细胞全部mRNA经反转录制备全套cDNA所建的文库称为cDNA文库。

二、目的基因与载体的连接：

(一) 载体：质粒、噬菌体、腺病毒DNA、逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA

(二) 质粒：

1 概念：染色体外能够独立复制、稳定遗传的一种环状双链DNA分子，在特定条件下可以可逆地整合到宿主染色体，随染色体复制而复制，通过细胞分裂传递到子代细胞。

2 理想质粒需要具备的条件：

(1) 分子量较小，3~10kb

(2) 松弛型复制子

(3) 带有可供选择的标记

a. 抗生素抗性标记

b. -半乳糖苷酶筛选标记

(4) 带有尽可能多的单一限制性内切酶位点

3 克隆型质粒：

PUC系列，PGEM系列

4 表达型质粒：

(1) 条件：强启动子及其两侧的调控序列；有SD序列且该序列与起始密码子ATG之间有合适的距离；克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止信号。

(2) 按表达方式分类：

非融合表达：外源基因不与细菌的任何蛋白或多肽（多由载体序列编码）融合在一起表达；

融合表达：外源基因与原核序列或其它序列编码的蛋白融合在一起表达；

分泌表达：表达载体上具有信号肽的顺序（取自原核细胞分泌蛋白的基因），下游紧接多克隆位点，外源基因产物可被分泌入细胞周质或细胞外。

(三)限制性内切酶

1 定义：是一类能识别并切割双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

2 分类：I、II、III型

II型：

(1) Mg2+作为辅因子

(2) 识别顺序一般为4~6个bp的回文结构

(3) 3种切口：平末端；5’粘末端；3’粘末端

(四) 把载体和目的基因连接成重组体：

用相同的限制性内切酶切割载体和目的基, 无论产生的是平末端还是粘末端切口，都可以用DNA连接酶把载体和目的基因连接起来。

三、重组DNA转入宿主细胞：

(一) 转化：质粒DNA进入细菌、酵母的过程。

1 化学法：当细菌处于0OC, 二价阳离子低渗溶液中时，菌体膨胀成球形（感受态）。同时，转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短时间热冲击，细胞通透性增加，吸收DNA复合物，在丰富培养基中生长数小时后球状细胞复原并增殖。

2 电转化：利用高压脉冲，在宿主细胞表面形成暂时性的微孔，质粒DNA乘虚而入。脉冲过后，微孔复原在丰富培养基中生长数小时后细胞增殖，质粒复制。

(二) 转染和感染：利用噬菌体DNA作载体时可经2种方式导入受体菌。

1 感染：在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，而后使其感染受体细胞。

2 转染：在DNA连接酶催化下使噬菌体DNA环化，再通过与质粒DNA相同的方式导入受体细胞。

四、重组子的筛选与鉴定：

从众多的转化菌落或转染噬菌斑中将含有重组DNA分子者挑选出来。

(一) 抗药性标记选择：

(二) 标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选，即标志补救。

(三) 酶切鉴定：对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，小量培养后提取质粒或噬菌体，用相应的内切酶进行切割，然后进行凝胶电泳检测载体中是否有目的基因的插入。

(四) PCR筛选重组子：以小量抽提的质粒 (或DNA) 作为模板, 设计与插入片段两端互补的引物进行PCR扩增，能扩增出目的片段的转化子即为重组子。

(五) 核酸分子杂交：将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维素膜上，用经过标记的特异性核酸探针与之杂交，，洗去非特异结合的探针，示踪标记将指示与探针互补的特异DNA片段所在的位置。

五、重组DNA的序列分析：

(一) Sanger双脱氧DNA链合成终止法

(二) 自动测序仪

六、重组DNA（重组表达载体）在表达宿主细胞中的表

(一)不同表达系统的特点和选择的原则：

1 大肠杆菌表达系统：

优点：

培养方法简单，增殖快，生产成本低。

融合表达时，往往可以获得理想表达量；表达产物受到保护而不易降解；易于分离纯化。

(2) 缺点：

缺乏真核细胞特有的翻译后加工，如糖基化修饰，磷酸化修饰，酰氨化修饰，二硫键形成等。

某些蛋白质表达的水平虽然很高，但不能正确折叠，以不溶的包涵体形式存在，对包涵体要经过变性和复性处理才可能获得生物活性，而复性处理对分子量大的尤其是分子内二硫键较多的蛋白，效率较低。

在菌体中非融合表达的外源性蛋白，在原核细胞中不稳定，易被菌体蛋白酶破坏；有时外源蛋白对细菌有毒性作用，限制细菌的生长浓度。

培养过程中，产生的内毒素难以除尽，影响产品的纯度。

2 酵母表达系统

(1)优点：

同细菌，培养方法简单，生长增殖快，生产成本低；

表达量较高；构建的菌株稳定；利用一些分泌型表达载体可以实现高水平的分泌表达；

单细胞真核生物，许多蛋白表达功能接近哺乳动物细胞，具有蛋白剪切、折叠和翻译后修饰功能。

(2) 缺点：

也具有活化的蛋白水解酶类，可降解异体蛋白质，使产量降低；

具有过度糖基化的特点，尤其是啤酒酵母，每条侧链上的甘露糖残基数目平均为50-150，过糖基化可能会影响蛋白的生物活性和免疫原性。

啤酒酵母表达产物会形成1,3糖苷键，具有高度免疫原性；

培养和筛选高表达株的周期比大肠杆菌表达系统长

3 昆虫细胞表达系统：

优点：

能较高水平地表达不同生物来源的基因，可以实现胞内表达，也可进行分泌表达。

能有效进行蛋白质翻译后加工，糖基化、脂酰化和磷酸化。

杆状病毒具有严格的宿主细胞专一性，对脊椎动物和植物均无致病性，也不能在非宿主细胞中繁殖或整合，使用较安全。

(2) 缺点：

生产成本较高，细胞培养操作较复杂

4 哺乳细胞表达系统：

(1) 优点：

最高级表达系统，能产生天然状态的蛋白质，能加工修饰，包括二硫键的形成，糖基化、磷酸化、寡聚体的形成，以及蛋白酶对蛋白质进行特定位点的切割。

(2) 缺点：

对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长。

表达水平低。