【原创\交流】PCR的一些体会，望大家交流！

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聚合酶链式反应(polymerase chain reaction ,PCR)是一种利用耐热的DNA聚合酶在体外扩增DNA的方法,为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

当DNA长度小于2kb时，一般PCR反应都问题不大，均较容易得到希望的条带；
但当DNA长度较长时，PCR就比较困难了，此时就需对PCR的条件进行优化，以获得期望的条带：

1. 模板
个人认为，PCR反应中最重要的部分就是模板，模板的种类、丰度、GC含量等都对PCR有很大的影响：

1.1 种类
一般我用过的PCR模板种类包括由细胞直接提取的基因组DNA，及由细胞提取的总RNA经反转录RT-PCR得到的cDNA。

基因组DNA，由于全部基因组全在其中，比较大，其形成二级结构的可能性就比较大，引物在退火时就比较困难,可以试试用酶切的方法解决：选择1-2种目的片段上没有的酶将基因组切碎，可能有助于打开二级结构。

用总RNA再RT-PCR获得的cDNA，主要问题就是RNA的降解。RT-PCR时若用oligo-dT做引物，获得的是mRNA，这是真核表达获得片段比较常用的方法(因为真核基因一般含有内含子)，此时在这一过程中注意RNA的降解问题就比较重要，一般要将所有试剂、枪头等用DEPC(0.1%)处理，其他还有一些注意事项可参看分子克隆。

1.2 丰度
这也是个很重要的影响因素，因为如果目的片段的丰度本身非常低的话，理论上虽也可扩增出来，但实际上由于基因组或cDNA库非常大，引物无论设计的有多好，其扩增出非特异片段的可能性都可能比目的片段还来的大，那得到目的片段就很困难了。此时最好的解决办法就是通过查阅文献，找到该目的片段丰度比较高的细胞来进行PCR，会有较好的效果，尤其是在真核细胞提取RNA反转录cDNA过程中，这个问题尤为重要！

1.3 GC含量
这个主要影响DNA内部形成二级结构的问题，一般可能在设计引物时会比较困难，扩增时最好也加入一些增强剂或优化剂。

2. 引物
引物设计的一般原则大家可能都很清楚，这里不再赘述。一般只需用一些引物设计软件，如Primer Premier 5.0等，基本就可以将引物设计的比较好了。
不过个人认为不用迷信这些一般原则或软件，我曾扩增过这样两个片段：一个片断引物设计时评分80多，但是扩增了1个多月没有结果；另一个评分17分，只做了一天就拿到了目的片断。主要原因个人认为还是在模板的丰度上，前一个片断用的不是该片断表达活性较高的细胞，而后一个片断用的是体内表达该片段最主要的细胞之一。

3. 退火温度与延伸时间
一般退火温度的选择,本人是根据Primer Premier 5.0推荐的退火温度再低5度左右开始进行。
一般退火温度越高，特异性上升，但效率下降(本来有的条带可能没了)
退火温度越低，特异性下降(出现非特异带)，但基本能扩增出来的条带就都出现了。
建议先选用比较低的温度开始，等扩出目的片断后，再适当提高退火温度减少非特异带。

至于延伸时间一般影响不大，只须注意用的是哪种酶。一般taq 1000-1200bp/分钟，pfu 600-800bp/分钟

4. 缓冲体系
一般公司卖的酶都配有buffer，通常情况下该buffer都没有问题了。只需有时候注意在扩增大片段时，一些离子对反应有抑制作用，如钾离子等，此时需做简单调整，如自己配buffer即可。

5. 酶
本人最常用的是pfu，taq两种酶。
其中taq较为便宜，扩增效率比较高，但是没有校正功能，再扩增大片段时可能有错配；
pfu的校正功能比较好，但扩增效率比taq要低，而且比taq稍贵一点。
个人认为一般taq都可将片断拿到，而pfu有时稍困难些，而且反应时间较长，因此一般第一次用taq扩增，拿到片断后再改pfu；而且如果做的是表达，一般最后一定用pfu，因为对片断正确性要求较高；而如果只是PCR验证，只需用taq就好了。

6. 增强剂与优化剂
如果片断内二级结构比较严重，有时可考虑加入增强剂或优化剂，其中DMSO比较常用，有些公司的增强剂、优化剂也可使用，不过个人认为一般这些的作用只是优化条件，使目的片断更明显、减少非特异条带。如果本身就一点扩不出来的话，用处也不是很大。



另外，对于大片段，还可以分段clone，将大片段分成1-2k左右的几个片断，中间重叠部分利用合适的酶切位点，再将几个片断拼接。
不过个人认为除非片段过大，比如大于4-5k，此时一次PCR的错配率可能较高，而且确实比较困难了；否则最好还是一次扩增拿到片段后续工作会少一点。

个人意见，希望大家讨论，给予指正和帮助！