【原创】RT-PCR相关问题专贴

为了方便大家系统理解操作RT-PCR，开个帖子,把有关有RT-PCR相关的问题一起统一回答.
如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。

现在将每一页的主要问题整理一下

1. RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题
2. 植物组织RNA提取的难点及对策
3. 如何确定RNA质量的经验谈
4. RNA提取常见问题分析

RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )
假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国产的 (这是完全可以使用的)。我的问题是：你采取了什么措施来降低或者杜绝 RNase 的污染？具体地：

你是如何选择、预处理、使用和保存氯仿和异丙醇？
你是如何配制和保存 75% 乙醇？

坦率地讲，因为有机试剂的问题导致抽提失败，我真没有听到；或许有的问题是由有机试剂导致，但使用人也多是不会怀疑到这一点的。恐怖分子的行为倒是听到过：对氯仿、75% 乙醇进行高压灭菌处理。令我无言的是，这样的恐怖行为既没有导致恐怖的后果，也没有影响实验的成功。

不过我还是想提供一些建议。我关注的是质量控制，而不是单单是简单或者方便。

RNA 抽提中涉及的有机试剂，包括苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇。苯酚多为商品化的东西了，选择和保存都不应该有什么问题；只强调一点：尽管 Tris 饱和的苯酚也可以用于 RNA 的抽提，但使用水饱和苯酚会更好一些，因为 RNA 在 pH 7 以上的溶液中，发生降解的机率大大提高。下面是关于氯仿、异丙醇、乙醇的有关建议。

选择
国内大的化学试剂公司生产或者监制的分析纯级别试剂就完全可以满足要求。

预处理
不需要进行任何的预处理。绝对不可以高温高压灭菌：这不是该不该的问题，而是能与不能的问题。这三个试剂的沸点都低于 100C，高温高压可能导致危险。

75% 乙醇的配制
一份无菌无酶的水与 3 份 (体积)无水乙醇混匀即成。不要使用量筒等过渡容器，使用天平来秤量：水的比重为 1，无水乙醇的比重按 0.785 计算。是先将无水乙醇倒出部分后再加入水，还是往装水的瓶子中加入无水乙醇，没有什么区别。事实上，70% - 80% 的乙醇都具有较好的洗涤能力，同时也不会导致片段比较大的核酸的丢失，所以，配制时就不要为了准确而左勾右兑的。关于现用现配，从质量控制角度看，不是一个好的办法；这也是你永远发现不了75% 可能会有问题的基础。75% 乙醇也不可以高温高压灭菌，原因同无水乙醇。

保存
首先，要使用新的试剂；试剂架上别人使用过并写有标记的，一定要找当事人确定，以防已被用于其它用途而标记未改。其次，分成相对小一点的包装 (50ml – 100ml)；500ml 的瓶子取液是非常不方便的，移液器的杆子往往都进入了瓶口里，非常容易造成污染。第三，塑料瓶子密闭性好，装醇类试剂是非常好的选择；但氯仿绝对不要使用塑料瓶子。第四，盖紧瓶盖，作好标记，再在瓶子上盖上一个透明塑料袋防尘。第五，保存于室温。
将有机试剂保存于冰箱的人不在少数，但这么做却是令人奇怪的。首先，任何挥发性的东西都不保存在冰箱 (除非万不得已，如 DEPC)，这应该成为一个良好的习惯。其次，与外面相比，冰箱除了灰尘少一点外，什么都会比外面多的。第三，在室温打开低温的瓶子，将导致空气大量进入瓶子，增加了污染的风险。

使用
非常幸运的是，有机试剂对菌污染和酶污染似乎有我们想象不到的抑制和灭活作用，所以，使用这些试剂没有特殊的要求，按正常抽提 RNA 的要求就完全可以了。吸取有机试剂时，最好使用比要吸取的体积大的移液器，因为有机试剂有越吸越多的现象，试剂容易接触到移液器的杆头 – 污染不说，氯仿会腐蚀杆头的。75% 乙醇使用一次性的吸管移取，一次可以吸数 ml，既快又方便。如果舍不得丢弃，用完后放入塑料自封袋中保存，是非常安全的。

植物组织RNA提取的难点及对策
　　从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。
　　从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA， 而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失［1］，或形成不溶性复合物［2］；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来［3］；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解［2］和酶解。对于这些植物材料，用常规的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常规的方法提取芒果果实的RNA时未能成功，他们的结果分为三种情况：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能进行体外翻译。他们认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其中也包含RNase，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA提取的因素［4］。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时，发现RNA与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收，从而干扰了RNA紫外吸收的测定［5］。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。本文根据文献综述了解决上述植物RNA提取过程中难点的相应对策。
1　酚类化合物的干扰及对策
　　许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）［6］和树木类植物中［1］富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多［1］。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）［7］。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物［8］。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。
1.1　防止酚类化合物被氧化的方法
　　还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸［9］来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％［10］。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物［7］。
　　螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去［6］。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低［11］。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用［6］。
　　Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂［4］。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率［7］。
　　牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性［6］。
　　丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA［1］。
　　Guillemant等［12］和Ainsworth［13］认为低pH值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合物的离子化和进一步的氧化。
1.2　酚类化合物的去除
　　通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去［6］。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理［14］。
2　多糖的干扰及对策
　　多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性［15］，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中［7］。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起［13］，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。
　　用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖［3］。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品［5］。
　　另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖［9］；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液［13］。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质［16］。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质［4］。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳［7］。
　　Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖［15］。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离［10］。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖［14］。
3　蛋白杂质的影响及对策
　　蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。
　　Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质［17］。
4　次级代谢产物的影响及对策
　　从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等［18］综合Hughes等［16］的选择性沉淀法、Chirgwin［19］的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。
　　由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。
　　随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路

如何确定RNA质量的经验谈

1）检测RNA溶液的吸光度

280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。

2）RNA的电泳图谱

一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。

电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。

以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。

下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

3）保温试验

方法很简单的，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

时间到了之后，取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，它们的条带也要符合方法2中的条件），则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。

RNA提取常见问题分析
◆ 得率低：
1. 裂解或匀浆处理不彻底。减少样品使用量，增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间。2. 处理样品太多。请参考最大处理量。
3. RNA仍在柱上未洗出。再次洗脱，加入RNase-Free 水后，放置几分钟离心。4. 洗出液中有酒精。漂洗后应再次离心，尽量去除漂洗液。
5. 未除净细胞培养液。收集细胞时，请注意尽量去除培养液。
6. 使用RNAstore保存的细胞:未有效离心。RNAlater密度大于一般的细胞培养
液，离心时应加大离心力，可以3000×g离心。
◆ A260/A280比值低：
洗脱时不使用RNase-Free 水，使用10 mM Tris.Hcl, pH 8.5作为洗脱液。
◆ RNA降解：
1. 提取的材料不新鲜。新鲜组织取得后应立即置于液氮中或立即放入RNAstore试剂中，以保证提取效果。
2. 处理样品量过大。
3. 污染了RNase。 虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase，但使用过程中很
容易污染RNase，应小心操作。
◆ DNA污染：
1. 处理样品量过大。
2. 有些样品本身DNA含量即较高，可使用DNase处理。得到的RNA溶液可加入DNase处理，处理后直接用于后续实验，也可用本试剂盒再进行一次纯化。