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外源DNA片段和线状质粒载体的连接

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外源DNA片段和线状质粒载体的连接,也就是在双链DNA5'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸,可生成4个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化,则吸能形成2个新的磷酸二酯链。

在这种情况下产生的两个杂交体分子布 有2个单链切口,当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化,这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。实际上在有克隆用途中,T4噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。这是因为在下沉反应条件下,它就能有效地将平端DNA片段连接起来。

DNA一端与另一端的连接可认为是双分子反应,在标准条件下,其反应速度完全由互相匹配的DNA末端的浓度决定。不论末端位于同一DNA分子(分子内连接)还是位于不同分子(分子间连接),都是如此。现考虑一种简单的情况,即连接混合物中只含有一种DNA,也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体DNA。

在瓜作用的底物。如果反应中DNA浓度低,则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大(因为DNA分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率)。这倦,在DNA浓度低时,质粒DNA重新环化将卓有成效。如果连接反应中DNA浓度有所增高,则在分子内连接反应发生以前,某一个DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA浓度高时,连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。

简而言之,环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数:j和i。

j是DNA分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度,j的数值是根据如下一种假设作出的:沉吟液中的DNA呈随机卷曲。这样,j与DNA分子的长度成反比(因为DNA越长,某一给定分子的两末端的越不可能相互作用),因此j对给定长度的DNA分子来说是一个常数,与DNA深度无关。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA长度,以cm计,b是随机卷曲的DNA区段的长度。b的值以缓冲液的离子强度为转移,而后者可影响DNA的刚度。

i是溶液中所有互补末端的深度的测量值,对于具有自身互补粘端的双链dna而言,i=2NoMx10-3末端/ml这里No是阿佛伽德罗常数,M是DNA的摩尔浓度(单位:mol/L)。理论上,当j=i时,给定DNA分子的一个末端与同一分子的另一末端,以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下,在反应的初始阶段中,环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当j>i时,有利于重新环化;当i>j,则有利于产生多联体。显示了DNA区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需DNA浓度之间关系。

现在考虑如下的连接反应混合物:其中除线状质粒之外,还含有布 匹配末端的外源DNA片段。对于一个给定的连接混合物而言,产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响, 而且还受质粒和外源DNA末端的相对浓度的影响。当i是j的2-3倍(即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求,而又不致引起大量寡聚体分子的形成时)外源DNA末端浓度的2倍时,有效重组体的产量可达到最大。这些条什下,连接反应终产物的大约40%都是由单体质粒与外源DNA所形成的嵌合体。当连接混合物中线瘃质粒的量恒定(j:i=3)而布 匹配末端的外源DNA的量递增时,这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。

涉及带粘端的线状磷酸化质粒DNA的连接反应应包含:

1)足量的载体DNA,以满足j:i>1和j:i<3。对一个职pUC18一般大小的质粒,这意味着连接反应中应含有载体DNA为20-60μg/ml。

2)未端浓度等于或稍高于载体DNA的外源DNA,如外源DNA浓度比载体低得多,在效连接产物的数量会很低,这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。这种情况下,可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。如用磷酸酶处理线状质粒DNA或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。

粘端连接

1)用适当的限制酶消化质粒和外源DNA。如有必要,可用凝胶电泳分离片段并(或)用碱性磷酸酶处理质粒DNA。通过酚:氯仿抽提和乙沉淀来纯化DNA,然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

2)按如下所述设立连接反应混合物:

a.将0.1μl载体DNA转移到无菌微量离心管中,加等摩尔量的外源DNA。

b.加水至7.5μl,于45℃加温5分钟以使重新退炎的粘端解链,将混合物冷却到0℃。

c.加入:10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1μl

T4噬菌体NDA连接酶 0.1Weiss单位
5mmol/L ATP 1μl
于16℃温育1-4小时
10xT4噬菌体DNA连接酶缓冲液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫苏糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白(组分V.Sigma产品)(可用可不用)
该缓训液应分装成小份,贮存于-20℃。

另外,再设立两个对照反应,其中含有(1)只有质粒载体;(2)只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足,每个连接反应可用50-100ng质粒DNA,并尽可能多加外源DNA,同时保持连接反应体积不超过10μl。可用至少3种不同方法来测定T4噬菌体DNA连接酶的活性。大多数制造厂商现在都用Weiss。1个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化1mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时,1个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位或者60个粘端单位(如New England Biolabs公司所定义)。

因此,0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16℃下30分钟内可使50%的λ噬菌体HindⅢ片段(5μg)得以连接。在本书中,T4噬菌体DNA连接酶一律用Weiss单位表示。\par 目前提供的T4噬菌体DNA连接酶均为浓溶液(1-5单位/μl),可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀释成100单位/ml的浓度置存。处于这种浓度并在这种缓冲液中的T4噬体DNA连接酶于-20℃保存3个月可保持稳定。3)每个样品各取1-2μl转化大肠杆菌感受态细胞。

平端DNA连接

T4噬菌体DNA连接酶不同于大肠杆菌DNA连接酶,它可以催化平端DNA片段的连接(Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978),由于DNA很容易成为平端,所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性,才能使任何DNA分子彼此相连。然而,相对而言,平端连接是低效反应,它要求以下4个条件:

1)低浓度(0.5mmol/L)的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981)。

2)不存在亚精胺一类的多胺。

3)极高浓度的连接酶(50Weiss单位.ml)。

4)高浓度的平端。

(1)凝聚剂
  在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成集体的物质,如聚乙二醇(Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高钴(Rusche和Howard-Flanders,1985),可以使如何取得适当浓度的平端DNA的总是迎刃而解。在连接反应中,这些物质具有两作用:

1)它们可使平端DNA的连接速率加大1-3个数量级,因此可使连接反应在酶DNA浓度不高的条件下进行。

2)它们可以改变连接产物的分布 ,分子内连接受到抑制,所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。这样,即使在有利于自身环化(j:i=10)的DNA浓度下,所有的DNA产物也将是线状多聚体。\par 在设立含凝聚剂的连接反应时,下列资料可供参考。

(2 )聚乙二醇(PEG8000)
  1)用去离子水配制的PEG8000贮存液(40%)分装成小份,冰冻保存,但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。在含15%PEG 8000的连接反应混合物中,对连接反刺激效应最为显著。除PEG 800和T4噬菌体DNA连接酶以外,其他所有连接混合物的组分应于0℃混合,然后加适当体积的PEG 8000(处于室温),混匀,加酶后于20℃进行温育。

  2)连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著,甚至ATP浓度略有增加或MgCl2浓度略有降低,都会严重降低刺激的强度(Pheiffer和Zimmerman,1983)。

  3)浓度为15%的PEG 8000可刺激带粘端的DNA分子的连接效率提高至原来的10-100倍,反应的主产物是串联的多联体。

  4)PEG 8000可刺激短至8个核苷酸的合成寡聚物的平端连接,在这一方面,它与氯化六氨合高钴有所不同。

(3 )氯化六氨合高钴
  1)氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃,它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时,其刺激作用最大。氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部,但只能使端连接的效率提高到原来的5倍(Rusche和Howard-Flanders,1985)。

  2)在单价阳离子(30mmol/L KCl)存在下,它对平端连接仍有一定的刺激作用,但此时连接产物的分布 有所改变。连接产物不再是清一色的分子间连接产物,相反,环状DNA将点尽优势。

  3)与PEG 8000不同,氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率

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