外源DNA片段在质粒载体中的克隆

DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。

实验目的： 学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。

实验材料： 外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。

实验原理： 限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

实验步骤：

1．载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：

（50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）：

DNA 30 ml

R.E 1 ml

10×buffer 5 ml

ddH 2 O 14 ml

37℃反应1hr，分别取8 ml 外源片段酶切产物和5 ml PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全；按2－5步纯化、回收DNA .

2．加入ddH 2 O 150 ml （扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000g离心10 min；

3．吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上；

4．12000g 4℃冷冻离心15分钟；

5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O（0.5ml tube中），PUC18溶于20 ml ddH 2 O（1.5ml tube中）；

6．按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50℃反应30 min 以上

DNA 20 ml

CIAP（TaKaRa） 0.5 ml

10 ´ buffer 4.0 ml

ddH 2 O 15.5 ml

附注：

1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。

2.克隆中用到的几种工具酶：

（1）限制性内切酶

限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在50 ml反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1mg DNA完全切割所需要的酶量。

限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。

（2）碱性磷酸酶

细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其可在70℃ 10’内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比BAP的高10－20倍。它主要用于：（1）克隆时去除载体的5’-P，以防载体自连；（2）在用 Kinase进行5’末端标记前，去除DNA的5’-P。

（3）连接酶

体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。

3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进。