在质粒载体中进行平末端片段的克隆实验
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原理
克隆平末端的目的片段时，为最大量地获得“正确”的连接产物，载体和目的 DNA 在连接反应中的比例必须适当。每一重组体中外源 DNA 的连接方向和插入数量都必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。作为一般规律，如果连接反应中质粒和目的 DNA 摩尔数相等，而且 DNA 的总浓度少于 100 μg/ml，获得一定数量的单体闭合重组子是可能的 ( Bercovich et al. 1992)。
材料与仪器
T4 噬菌体 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶
ATP 乙醇 聚乙二醇 乙酸钠 TE
琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
ATP 乙醇 聚乙二醇 乙酸钠 TE
琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
ATP (10 mmol/L)，乙醇，聚乙二醇（30%，m/V，PEG 8000 溶解），乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2 )，TE ( pH 8.0)。
2. 酶与缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶，限制性内切核酸酶。
3. 凝胶
琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶。
4. 核酸和寡核苷酸
外源或目的 DNA ( 带平末端），载体（质粒）DNA。
二、方法
1. 分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化 1~10 μg 质粒 DNA 和外源 DNA 片段，使它们能产生平末端。
2. 苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源 DNA 片段。
根据实验情况，参照中性琼脂搪凝胶或聚丙嫌酰胺凝胶电泳方法从分离出外源 DNA 的目的片段，是必要的或可以获得理想结果的。当外源 DNA 制备物中含有能与载体连接的多个限制酶酶切片段时，一般需要做这种分离。许多研究者在连接反应前，宁愿采用琼脂糖凝胶电泳方法来提高外源目的 DNA 序列的钝度，而不是从大量的转化子中筛选阳性克隆。
3. 分别用 TE ( pH 8.0) 重新溶解纯化出的两种 DNA 沉淀，使终浓度约为 100 ng/ml。假设 1 bp 相当于 660Da，计算 DNA 的终浓度（pmol/ml)。
分别取少量样品，用琼脂糖凝胶电泳确定两种 DNA 的近似浓度（取整数）。
4. 将载体 DNA 去磷酸化。
5. 按下表将适量的 DNA 转移至无菌的 0.5 ml 离心管：
(1) A、B 和 C 管中加入：10x 连接缓冲液 1.0 μl，T4 噬菌体连接酶 0.5 Weiss 单位，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 补至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl。
(2) D、E 和 F 管中加入：10x 连接缓冲液 1.0 μl，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 补至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl，不加 DNA 酶。
为获得最大的连接效率，反应体系越小越好，一般为 5~10 μl。在反应混合物中，ATP 作为 10X 连接缓冲液的组分，给载体和外源 DNA 片段提供了更为广阔的空间。有些厂家的连接缓冲液中含有 ATP，这样在应用时就不必另加 ATP 了。
在制备 DNA 片段过程中，可以将 DNA 片段与水一起加入管中于 45℃ 温育 5 min，以消除制备过程中片段间可能形成的聚合。在连接反应试剂加入之前，可将 DNA 溶液于 0℃ 预冷。关键的地方是：① 在加入 PEG (30%) 之前使反应体系预热至室温；② 最后加入 PEG。否则，在 PEG 8000 存在的低温溶液中 DNA 会形成沉淀。
6. 连接反应体系置于 16℃ 水浴温育过夜或 20℃ 水浴温育 4 h。
7. 用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为对照，以检査转化效率。
1. 缓冲液和溶液
ATP (10 mmol/L)，乙醇，聚乙二醇（30%，m/V，PEG 8000 溶解），乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2 )，TE ( pH 8.0)。
2. 酶与缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶，限制性内切核酸酶。
3. 凝胶
琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶。
4. 核酸和寡核苷酸
外源或目的 DNA ( 带平末端），载体（质粒）DNA。
二、方法
1. 分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化 1~10 μg 质粒 DNA 和外源 DNA 片段，使它们能产生平末端。
2. 苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源 DNA 片段。
根据实验情况，参照中性琼脂搪凝胶或聚丙嫌酰胺凝胶电泳方法从分离出外源 DNA 的目的片段，是必要的或可以获得理想结果的。当外源 DNA 制备物中含有能与载体连接的多个限制酶酶切片段时，一般需要做这种分离。许多研究者在连接反应前，宁愿采用琼脂糖凝胶电泳方法来提高外源目的 DNA 序列的钝度，而不是从大量的转化子中筛选阳性克隆。
3. 分别用 TE ( pH 8.0) 重新溶解纯化出的两种 DNA 沉淀，使终浓度约为 100 ng/ml。假设 1 bp 相当于 660Da，计算 DNA 的终浓度（pmol/ml)。
分别取少量样品，用琼脂糖凝胶电泳确定两种 DNA 的近似浓度（取整数）。
4. 将载体 DNA 去磷酸化。
5. 按下表将适量的 DNA 转移至无菌的 0.5 ml 离心管：
(1) A、B 和 C 管中加入：10x 连接缓冲液 1.0 μl，T4 噬菌体连接酶 0.5 Weiss 单位，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 补至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl。
(2) D、E 和 F 管中加入：10x 连接缓冲液 1.0 μl，5 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 补至 8.5 μl，30% PEG 8000 1~1.5 μl，不加 DNA 酶。
为获得最大的连接效率，反应体系越小越好，一般为 5~10 μl。在反应混合物中，ATP 作为 10X 连接缓冲液的组分，给载体和外源 DNA 片段提供了更为广阔的空间。有些厂家的连接缓冲液中含有 ATP，这样在应用时就不必另加 ATP 了。
在制备 DNA 片段过程中，可以将 DNA 片段与水一起加入管中于 45℃ 温育 5 min，以消除制备过程中片段间可能形成的聚合。在连接反应试剂加入之前，可将 DNA 溶液于 0℃ 预冷。关键的地方是：① 在加入 PEG (30%) 之前使反应体系预热至室温；② 最后加入 PEG。否则，在 PEG 8000 存在的低温溶液中 DNA 会形成沉淀。
6. 连接反应体系置于 16℃ 水浴温育过夜或 20℃ 水浴温育 4 h。
7. 用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为对照，以检査转化效率。
来源：丁香实验
