在质粒载体中进行平末端片段的克隆

 

在质粒载体中进行平末端片段的克隆

 

1． 分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化 1~10 μ g 质粒 DNA 和外源 DNA 片段，使它们能产生平末端。

2． 苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源 DNA 片段。

3． 分别用 TE （ pH 8.0 ）重新溶解纯化出的两种 DNA 沉淀，使终浓度为 100 ng/ml 。 假设 1 bp 相当于 660 Da ，计算 DNA 的终浓度（ pmol/ml ）。

4． 将载体 DNA 去磷酸化。

5． 按下表将适量的 DNA 转移至无菌的 0.5 ml 离心管：

   

管号	DNA
A 和 E	载体 1 [60fmol (~100ng)]
B	外源插入片段 2 [60fmol (~10ng)]
C 和 F	载体 1 （ 60fmol ）和外源插入片段 3 （ 60fmol ）
D	线状载体（ 5’- 磷酸化）（ 60fmol ）
G	环状载体 [60fmol (~10ng)]

¹ 载体 DNA 已进行去磷酸化

² 外源目的 DNA 可以连接接头。

3 连接反应中，质粒载体和插入的 DNA 片段摩尔比一般为 1 ： 1 。 DNA 的总浓度应约为 10ng/ μ l 。

 

 

a.       A 、 B 和 C 管中加入：

   10 ×连接缓冲液       1.0 μ l

   T4 噬菌体连接酶       0.5 Weiss 单位

   5 mmol/L ATP        1.0 μ l

   H₂ O                  补至 8.5 μ l

   30%PEG 8000          1~1.5 μ l

b.      D 、 E 和 F 管中加入：

   10 ×连接缓冲液       1.0 μ l

   5 mmol/L ATP         1.0 μ l

   H₂ O                  补至 8.5 μ l

   30%PEG 8000          1~1.5 μ l

   不加 DNA 酶

 

 

6． 连接反应体系置于 16 ℃水浴温育过夜或 20 ℃水浴温育 4 h 。

7． 用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为对照，以检查转化效率。

管号	DNA	连接酶（有 / 无）	预期转化克隆数
A	载体 1	+	~03
B	插入片段	+	0
C	载体 1 和插入片段	+	比 F 管高 5 倍
D	载体 1	-	~0
E	载体 2	-	比 D 管高 50 倍
F	载体和插入片段	-	比 D 管高 50 倍
G	环状质粒	-	2 × 105

¹ 去磷酸化

² 未去磷酸化

³ 如果出现来自去磷酸化的载体 DNA 自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽 5’ 端的磷酸基。