外源DNA片段在质粒载体中的克隆

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　　DNA重组技术包括载体 及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。

　　实验目的：学习DNA 的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUC18载体上。

　　实验材料：外源片段来自一个含有水稻dna片段 的BAC克隆的酶切片段;克隆载体为PUC18。

　　实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应;选择克隆载体pUC18多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连;在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。

　　实验步骤：

　　1.载体pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：

　　(50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作)：

　　DNA 30 ml

　　R.E 1 ml

　　10×buffer 5 ml

　　ddH2O 14 ml

　　37℃反应1hr，分别取8 ml 外源片段酶切产物和5 ml PUC18酶切产物于1.0%凝胶检测酶切是否完全;按2-5步纯化、回收DNA

　　2.加入ddH2O 150 ml (扩大体积)，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀，12000g离心10 min;

　　3.吸取上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分钟以上;

　　4.12000g 4℃冷冻离心15分钟;

　　5.倒去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10 ml ddH2O(0.5ml tube中)，PUC18溶于20 ml ddH2O(1.5ml tube中);

　　6.按以下反应去除载体PUC18的5’磷酸基团，50℃反应30 min 以上

　　DNA 20 ml

　　CIAP(TaKaRa) 0.5 ml

　　10 ´ buffer 4.0 ml

　　ddH2O 15.5 ml

　　1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。

　　2.克隆中用到的几种工具酶：

　　(1)限制性内切酶

　　限制性内切酶的一个活性单位(1U)：指在50 ml反应体系中，37℃下，经过1小时的反应将1mg DNA完全切割所需要的酶量。

　　限制性内切酶的star活性：限制酶在某些条件下使用时对DNA切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现与限制酶、底物DNA以及反应条件有关。

　　(2)碱性磷酸酶

　　细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)都能催化水解DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’-磷酸残基。比较而言，CIAP更常用，因其可在70℃ 10’内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时CIAP的活性比BAP的高10-20倍。它主要用于：(1)克隆时去除载体的5’-P，以防载体自连;(2)在用 Kinase进行5’末端标记前，去除DNA的5’-P。

　　(3)连接酶

　　体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。

　　3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。