λ噬菌体臂与外源基因组DNA片段的连接实验

当 λ 噬菌体臂与外源基因组 DNA 片段相连时，必须考虑到两个参数：噬菌体臂与潜在插入片段的摩尔比，以及在反应混合物中各类 DNA 的浓度。

噬菌体 T4 DNA 连接酶 基因组 DNA λ 噬菌体包装混合物 λ 噬菌体臂 DNA
ATP SM 和 SM+ 明胶
琼脂糖凝胶 LB 或 NZCYM 琼脂平板 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP ( 10 mmol/L)

SM 和 SM+ 明胶

2. 酶和缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.7%）, 用 0.5X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

4. 核酸和寡核苷酸

适当大小的基因组 DNA，用于载体克隆

5. 培养基

LB 或 NZCYM 琼脂平板

LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖

6. 专用设备

预置于 47℃ 的加热仪或水浴（用于顶层琼脂糖)

预置于 16℃ 的水浴

7. 载体和菌株

λ 噬菌体包装混合物

λ 噬菌体臂 DNA

二、方法

1. 建立含有如下物质的一系列连接反应：

λ 噬菌体臂 0.5~1.0 μg，部分酶切基因组 DNA 6~1200 ng，10X 连接缓冲液 0.5~1.0 μl，10 mmol/L ATP（若必需） 0.5~1.0 μl，噬菌体 T4 DNA 连接酶 0.5~1.0 μl，水 至 5 或 10 μl。

建立两个对照反应，其中载体和插入 DNA 任缺其一。将连接反应置 16℃ 温育 4~16 h。

为了获得最大的连接效率，建立体积尽可能小的反应体系（5~10 μl）。若 ATP 作为 10X 连接缓冲液的一种组分加入反应混合物中，则将给载体或外源 DNA 留出更大的体积。

如果应用含 ATP 的商品化连接缓冲液，则省略 ATP。

2. 在各连接反应中取 10%~25% 的组分，按照生产商提供的关于包装提取物的说明包装入噬菌体颗粒。

大多数的生产商都提供入噬菌体 DNA 对照，作为检测包装效率的标准。

3. 将包装反应进行 10 倍系列稀释（10^-1~10^-5），用 SM+ 明胶或厂家推荐的相应缓冲液作为稀释液。

4. 分析每个稀释度 1 μl 和 10 μl 所形成噬菌斑的数量。

5. 从得到感染性噬菌体颗粒最多的连接反应中，挑取 6~12 个噬菌斑，从每个噬菌斑制备小量重组 DNA。

6. 用适当的限制酶消化，随后进行 0.7% 的琼脂糖凝胶电泳，并使用适宜的分子质量标准，检测所插入基因组 DNA 的大小。

7. 如果噬菌体是重组子且含有合适大小的插入片段，则通过建立多个连接和包装反应构建基因组 DNA 文库。在这些反应中插入片段和载体 DNA 的比值应是，在试反应中产生最多重组噬菌斑所采用的比值。

8. 估算大规模连接和包装反应所产生的所有重组噬菌斑的量，并计算如此大小的文库所能覆盖整个目标基因组的程度。

为了对某一哺乳动物基因组（3X10⁹ bp ) 提供一个 5 倍的覆盖率，则一个平均含有 20 kb 插入片段的 λ 噬菌体文库需包含 2X10⁶ 个独立的重组子。