蛋白质双向电泳过程与体会

双向电泳IEF (sigma) IEF（not IPG）/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的.

IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS-PAGE用六一厂的就可以了(推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧）

BIO－RAD 的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为上槽Biorad 的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

双向电泳

蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存 。

2 蛋白质浓度测定

按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做 。

2.3.1 电聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管准备

干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里 面1hr，轰干就可以用了.

2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦灌IEF的配方为

3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62)

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8卫生 10%AP

1.8卫生 TEMED

用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/l NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50m mol/l NaOH 液，下槽（正极）为25m mol/l H3PO4。按200V×15min，300V× 30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好。

2.3.1.3 电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。

漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来, 注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿！还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。

注意到下级液磷酸部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵!

对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。

2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

选用DYY-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2 边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！

做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE 胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2％的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m mol/LTris，192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20 度左右,(这个温度我也没控制的)100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

100%TCA 10ml

2-ME 0.07ml

丙酮 90ml

0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:

2-ME 0.07ml

丙酮 100ml

0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)

50ml

Urea 28.5g

NP-40 1ml

Ampholine 5~7 2.0ml

3.5~10 0.5ml

2-ME 2.5ml

注意定容！配好后用1.5ml 管分装！-70度保存

注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37 度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml

(2002-10-30 18:39:37)

UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)

25ml 50ml

Urea 14.25g 28.5g

K2CO3 17.25mg 34.5mg

SDS 0.3125g 0.625g

DTT 0.125g 0.25g

2-ME

Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml

Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 枪，4枪)

2-ME 可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！

双向电泳IPG（summer）

一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法

（1） 在液氮中研磨叶片

（2） 加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。

（3） 加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。

（4） 上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

二、一向电泳（13cm的holder）

（1） 取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl

（2） 将上述溶液加到holder 的两个电极之间。

（3） 去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。

（4） 在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。

（5） 将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。

（6） 设置仪器的运行参数：

三、胶条的平衡（由一向到二向）

（1） 将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（2） 将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（3） 用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。

四、二向电泳

（1） 将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳。

（2） 设置仪器的运行参数：

五、平板胶的染色

硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）

（1） 固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。

（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。

（3） 清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。

（4） 银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。

（5） 显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。

（6） 终止：5%的醋酸。

（7） 照相分析。

（8） 保存制作干胶。

药品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。

平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87%的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。

制作平板胶：

分离胶的配制方法：

药品/浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%

丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml

分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml

无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml

10%过硫酸胺_200vl_200vl_200vl_200vl_200vl_~K~Hp~M~2~1~Kp~MTEMEundefined 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl

药品配制：

丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调PH8.8总体积1000ml10%SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10%的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml

封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）

原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G－250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的

大小计算蛋白的含量。

溶液：

1）Bradford储存液

100ml95%乙醇

200ml88%磷酸

350mgServaG蓝

室温下长期保持稳定。

2）Bradford工作液

425ml双蒸水

15ml95%乙醇

30ml88%磷酸

30ml Bradford储存液

用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。

3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）

做标准曲线：

取样品即可测量。

注意事项：

1、样品的问题:样品制备是做好2-d 的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛呀！另外再说明一点，最好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80 的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。

2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D 图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖，这是最讨厌的问题。

3、跑一向的时候大家都差不多，根据公司的说明就可以做了。跑二向的时候我现在一般做恒压，以前做过恒流，没感觉有什么差异，还想请教各位！横流和恒压到底哪个更好一些！

4、ipg 胶条ph 的选择，我做的是植物的花药，一般情况下酸性端点多一点，碱性端较少，我现在选用的是ph3-10 的，我觉得很不合适，（不过这个胶条是免费的）因此好多点没能很好的分开，如果胶条的ph小一点，胶条（我希望能达到18cm）可是我们这里做不了，效果应该比这个好很多的！

5、从这块胶上，我觉得致命点就是背景深，将影响我下一步的分析。所以银染还需要改进！

6、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度也是可以调节的，我比较懒，就作过10%，12.5%的，不过觉得都不适合。