蛋白质双向电泳过程与体会

双向电泳IEF （sigma）IEF（not IPG）/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！

IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS-PAGE用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了）（money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）

BIO－RAD 的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

双向电泳

1.蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇），再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

2 蛋白质浓度测定

按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做

2.3.1 电聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管准备

干净玻管（18cm×1.5mm）用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记，垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后；用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水；后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.

2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦

灌IEF的配方

为3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息现案 （ACR 28.38 BIS 1.62）

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8卫生 10%AP

1.8卫生 TEMED

用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口，不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。

电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH 液，下槽（正极）为25m mol/L H3PO4。按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右，特别是冬天，我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱（密封）里.呵呵，应该可以想象得到吧，第一向温度特别重要，不然，电聚焦肯定做不好.

2.3.1.3 电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。

取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。漫漫挤，管子，200 卫生枪头，注射器，要成一直线，,要用一手扶着管子，一手拿住200 卫生枪头，保证水不从枪头和管子处流出来，注射器顶在胸前把胶条挤出后，放在12%TCA里面，在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。

绝招哦，不要随便乱传，嘿嘿！还可以马上看一下，胶条上有蛋白质没有，有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里，-20 度的，肯定不行，呵呵！就跟你用考染IEF 胶条一样的，带，可能先在12%的TCA 里面看不见，不过你再把它放在水里面，泡一会带就出来了。不过在平衡之前，要用dd water泡30min，而且要换至少5 次水，每次用不同的小平皿。

注意到下级液 磷酸 部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵！

对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。

2.3.2 第二向SDS^-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

选用DYY^-Ⅲ型（北京六一仪器厂生产）电泳槽（规格为200×200×1mm），分离胶浓度为12%，无浓缩胶。待胶聚合后，将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端（避免胶条拉直），并用1%琼脂糖（电极缓冲液配制）封胶，特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮。61厂板子之灌胶：坚决不用凡士林，用透明胶将两端（板子的2 边）封住，再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底，待琼脂凝固后再灌胶，最后用水封胶。over！

做之前，一定要保证，1，灌胶不会有任何问题，不能漏，2，不用浓缩胶，只用分离胶。3，分离胶用水封，要保证凝聚好的PAGE 胶，为一平的线，凹来凸去的就不要用了。玻璃版能用硅化剂最好不过了。防止从边上漏，我用透明胶（约4cm宽），封住两边，下面还是用2%的琼脂封。灌好电极缓冲液[25m mol/LTris，192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS]，按25mA/板胶恒流进行电泳，待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳，一般电泳耗时约4-5h。银染：凝胶于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者过夜；用水洗1次，5min；30%乙醇洗2×20min；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸钠1min；水洗3×20s；0.2%硝酸银，0.02%甲醛快速的润洗一次，就是过一下的意思，到这个溶液进去，马上又倒掉；0.2%硝酸银，0.02%甲醛20min；水洗3×20s；显色液（3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠）快速的润洗一次，就是过一下的意思，到这个溶液进去，马上又倒掉；显色液（3%碳酸钠，0.05%甲醛，0.0005%硫代硫酸钠）显色到你所希望的程度，自己看，背景好，点又多的话就可以了；水洗20秒；0.05%甘氨酸停显。染色理想温度：我去年4，5月时，通常染色都定在中午，12点多；温度最好是20 度左右，（这个温度我也没控制的）100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA，0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：

100%TCA 10ml

2-ME 0.07ml

丙酮 90ml

0.07%2-ME 丙酮 （100ml）：

2-ME 0.07ml

丙酮 100ml

0 Farrel 液（9.5M Urea，2%NP-40，0.4%Am3.5~10，1.6%5~7，5% 2-ME）

50ml

Urea 28.5g

NP-40 1ml

Ampholine 5~7 2.0ml

3.5~10 0.5ml

2-ME 2.5ml

注意定容！配好后用1.5ml 管分装！-70度保存

注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面，用记号笔标上刻度，然后把水倒掉，再称 尿素 小量加水，因为尿素加水后体积会变大，再37 度水域锅里溶，然后加其它成分，最后再定到50ml

（2002-10-30 18：39：37）

UKS液 （含9.5M Urea，5mMK₂CO₃，1.25%SDS，0.5%DTT，2%Ampholine（3.5~10），6%Triton X-100）

25ml 50ml

Urea 14.25g 28.5g

K₂CO₃ 17.25mg 34.5mg

SDS 0.3125g 0.625g

DTT 0.125g 0.25g

2-ME

Ampholine（3.5~10）1.25ml 2.5ml

Triton X^-100 1.5ml 3ml（0.86ml 2 枪，4枪）

2-ME 可适当加一些！注意定容！配好后用1.5ml管分装！-70度保存！

双向电泳IPG（summer）

一、样品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法

（1）在液氮中研磨叶片

（2）加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1 小时）弃上清。

（3）加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。

（4）上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。

（5）用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

二、一向电泳（13cm的holder）

（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl

（2）将上述溶液加到holder 的两个电极之间。

（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。

（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。

（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。

（6）设置仪器的运行参数：

三、胶条的平衡（由一向到二向）

（1）将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（2）将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。

（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。

四、二向电泳

（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.

（2）设置仪器的运行参数：

五、平板胶的染色

硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）

（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。

（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。

（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。

（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。

（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml 去离子水。

（6）终止：5%的醋酸。

（7）照相分析。

（8）保存制作干胶。

药品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。

平衡缓冲液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml，尿素72.07g ，87%的甘油69ml，SDS 4g，溴酚蓝少许。溶涨液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚蓝少许溶于无菌水中，总体积为25ml。使用之前再加入IPG缓冲液0.5vl/100vl，DTT1.5vl/100vl。

制作平板胶：

分离胶的配制方法：

药品/浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%

丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml

分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml

无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml

10%过硫酸胺_200vl_200vl_200vl_200vl_200vl_~K~Hp~M~2~1~Kp~MTEMEundefined 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl

药品配制：

丙烯酰胺单体储液：丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液：Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调pH8.8总体积1000ml10%SDS：SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10%的过硫酸胺：0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml

封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法（Bradford 方法）

原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G－250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465－595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的

大小计算蛋白的含量。

溶液：

1）Bradford储存液

100ml95%乙醇

200ml88%磷酸

350mgServaG蓝

室温下长期保持稳定。

2）Bradford工作液

425ml双蒸水

15ml95%乙醇

30ml88%磷酸

30ml Bradford储存液

用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。

3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）

做标准曲线：取样品即可测量。

注意事项：

1、样品的问题：

样品制备是做好2-d 的关键，这句话好象有点多余，如果样品中离子浓度过大，根本做不了2d，我开始的时候由于提取方法有问题，结果浪费了很多时间和IPG胶条，真的很心痛呀！另外再说明一点，最好用新鲜的样品提取蛋白质，蛋白点的差异很大，新鲜的样品点多，而我用存放在-80 的样品跑出来效果差了很多呀！如果你不确定你的蛋白提的如何，建议你先跑sds-page。检验一下。关于蛋白的提取方法，我还想听听各位的建议。

2、上样量的问题，我觉得我跑的这张2D 图，上样量还需要调整，可以适当降低，我的ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖，这是最讨厌的问题。

3、跑一向的时候大家都差不多，根据公司的说明就可以做了。跑二向的时候我现在一般做恒压，以前做过恒流，没感觉有什么差异，还想请教各位！横流和恒压到底哪个更好一些！

4、ipg 胶条ph 的选择，我做的是植物的花药，一般情况下酸性端点多一点，碱性端较少，我现在选用的是ph3-10 的，我觉得很不合适，（不过这个胶条是免费的）因此好多点没能很好的分开，如果胶条的ph小一点，胶条（我希望能达到18cm）可是我们这里做不了，效果应该比这个好很多的！

5、从这块胶上，我觉得致命点就是背景深，将影响我下一步的分析。所以银染还需要改进！

6、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度也是可以调节的，我比较懒，就作过10%，12.5%的，不过觉得都不适合。