蛋白质双向电泳过程与体会

双向电泳IEF （sigma）IEF（not IPG）/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！

IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS-PAGE用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了）（money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵）

BIO－RAD 的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。

双向电泳

1.蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1 小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇），再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10），6% Triton X-100]，37℃育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

2 蛋白质浓度测定

按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4℃，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做

2.3.1 电聚焦（IEF）

2.3.1.1 玻管准备

干净玻管（18cm×1.5mm）用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记，垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后；用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水；后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr，轰干就可以用了.

2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦

灌IEF的配方

为3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息现案 （ACR 28.38 BIS 1.62）

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8卫生 10%AP

1.8卫生 TEMED

用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口，不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。

电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH 液，下槽（正极）为25m mol/L H3PO4。按200V×15min，300V×30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右，特别是冬天，我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱（密封）里.呵呵，应该可以想象得到吧，第一向温度特别重要，不然，电聚焦肯定做不好.

2.3.1.3 电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始做的时候肯定不熟，很不爽，有时候你会唱 想哭却又哭不出来，呵呵，熟悉了就快了，注射器 枪头 玻璃管必须为一直线，消息不要把注射器的头搞断了。

取一胶条，用双蒸水洗净两端，按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段，各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜，次日用酸度计分别测定各段的pH值，以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标作图，即为等电点标准曲线。漫漫挤，管子，200 卫生枪头，注射器，要成一直线，,要用一手扶着管子，一手拿住200 卫生枪头，保证水不从枪头和管子处流出来，注射器顶在胸前把胶条挤出后，放在12%TCA里面，在4度可以保存很久，想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。

绝招哦，不要随便乱传，嘿嘿！还可以马上看一下，胶条上有蛋白质没有，有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里，-20 度的，肯定不行，呵呵！就跟你用考染IEF 胶条一样的，带，可能先在12%的TCA 里面看不见，不过你再把它放在水里面，泡一会带就出来了。不过在平衡之前，要用dd water泡30min，而且要换至少5 次水，每次用不同的小平皿。

注意到下级液 磷酸 部分的胶条没，是不是有一节约2cm左右，比较突出，没有膨大的部分呀！只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢，大约3cm左右，呵呵！

对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8），10%甘油，5%β－巯基乙醇，0.1%溴酚蓝]进行二次平衡，第一次20min，第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。