材料与仪器
待测血清
生理盐水 琼脂粉
载玻片 打孔器 微量进样器
生理盐水 琼脂粉
载玻片 打孔器 微量进样器
步骤
1. 取一清洁载玻片，倾注3.5~4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2. 凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图2所示。
图2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3. 用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4. 加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。
5. 结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。
6. 结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。
（1）抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。
图3 双扩散试验结果示意图
A：已知抗体 a、b：阳性对照
c、d、e、f：被检材料
（2）抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。
图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系
a、b：抗体 A、A’、B：抗原
A、B完全不同 A、A’部分相同
（3）温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
（4）琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。
（5）参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25~0.5 cm 为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。
（6）时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
来源：丁香实验
