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琼脂扩散试验(单向和双向)

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实验原理

1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验,将抗体混合于琼脂内,倾注于玻片或平皿上,凝固后在琼脂上打孔,再将抗原标本加入孔内,经过一定的时间,在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环,环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线,则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。

2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如两者相对应,浓度比例合适,则经一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线,若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。

实验步骤

1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定

1) 材料

IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。
2) 方法

a. 免疫琼脂板制备:将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成),加热溶化,待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度),混匀,制成厚1.5mm的琼脂板,待琼脂凝固后打孔,孔径为3mm,孔距1~1.2cm。
b. 稀释参考血清及待检血清:参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用,参考血清、待检血清稀释按要求进行。
c. 加样:将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内,其余孔滴加待检的稀释血清,每个检样加两个孔,每孔滴加10微升。
d. 扩散:将免疫板置水平湿盘内,放进37℃温箱,IgG免疫板扩散24小时,IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果,(如果沉淀环不清晰,也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察),必要时可以染色后观察。
e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定:测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关,还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关,而是对数关系,这种关系有两种计算方法:
Mancini曲线-适用于大分子抗原和长时间扩散(>48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线,沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示:C/d2 =K(C=抗原浓度,d=沉淀环直径,K=常数)。
Fehey曲线-适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线,浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示:logC/d=K(C=抗原浓度,d=沉淀环直径,K=常数)。

2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)
1) 材料

羊抗人全血清,小牛血清,正常人混合血清,精制琼脂粉,生理盐水、载玻片,打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。

2) 方法
a. 用生理盐水配制1.0~1.5%琼脂,隔水煮沸使溶化,用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上,制成琼脂板。
b. 待琼脂凝固后,按右图用打孔器打孔,并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。
c. 在①孔中加正常人混合血清,在②孔中加小牛血清,③孔中加羊抗人全血清,注意不要溢出。
d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内,于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

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