单向凝胶电泳实验

一、步骤

1. 储备液

(1) 丙烯酰胺浓缩液 ( 3 0 % T 、2. 7 % C : 将 29. 2 g 丙烯酰胺和 0. 8 g 双丙烯酰胺溶解于 70 m L 去离子水中。当丙烯酰胺完全溶解后，加 水 定 容 至 IOO m L 。采 用 0.45 um滤膜将溶液进行真空抽滤。将丙烯酰胺储备液于 4° C 保存在深色瓶中，且保存时间不得超
过 1 个月。警示: 丙烯酰胺单体是一种神经毒素。应避免吸人丙烯酰胺粉末, 不得用嘴进行丙烯酰胺溶液的移液，在处理丙烯酰胺粉末或含丙烯酰胺的溶液时均需戴上手套。未用完的丙烯酰胺的处理方法为，加人双丙烯酰胺 (如果丙烯酰胺溶液中不存在双丙烯酰胺 ），诱导聚合作用，并丢弃凝固化的胶。

(2) I.5 m o l / L T r i s - H C U p H 8. 8, 浓缩的分离胶缓冲液： 将 18. 2 g T r i s 碱溶解于约80 m L 水 中 ，H C l 调 节 p H 至 8. 8, 再加水定容至 100 m L 。 4°C 保存。

(3) 0. 5 m o l / L T r i s - H C U p H 6. 8, 浓缩的积层胶缓冲液： 将 6. I g T r i s 碱溶解于约80 m L 水 中 ，H C l 调 节 p H 至 6. 8, 再加水定容至 100 m L 。 4°C 保存。

(4) 1 0 % ( m/V ) 十二烷基磺酸钠 (S D S ) : 将 10 g S D S 溶 解 于 约 60 m L 水中，再加水定 容 至 100 m L 。

(5) 样品储备缓冲液 [〇. 〇 6 m o l / L Tris-H C l (p H 6. 8)、2 % S D S 、1 0 % 甘油、0. 0 2 5 % 溴酚蓝]

3. 电 泳 缓 冲 液

电泳缓冲液：0.025 moI/L T ris、0.192 m ol/L 甘氨酸、0. l % ( m/V)SDS,pH 8. 3(每100 m L 电泳缓冲液中含有 0.3 g T r is 碱 、1. 4 g 甘氨酸、 I mL 1 0 % SDS)。不用调节电泳缓 冲 液 的 p H ; 仅将试剂溶解在一起并且确保 PH 在 8. 3 附近（±0. 2)。电泳缓冲液可被制 备 成 5 X 的浓缩液, 每升含有 15 g T r is 碱 、72 g 甘 氨 酸 及 5 g SDS。 5 X 的电泳缓冲浓缩液必须保存在玻璃容器中。使用之前，用 4 倍体积水稀释。

4. 凝 胶 制 备

使用去污剂彻底清洁玻璃板、垫片、齿梳以及凝胶装置的上层缓冲液池，再用水冲洗干净。在装配设备时应戴手套。首先灌制分离胶, 然后再用积层胶覆盖。

(1) 装配倒胶装置，根据厂商说明或通过计算确定凝胶用量。在 分 离 胶 上 使 用 1〜2 cm 的积层胶。通过在两块玻璃板间插入形状良好的齿梳，并使外部的玻璃板比齿梳的齿 部 低 1〜2 cm，以此来决定所倒的分离胶的高度。

⑵ 混 合 除 A P S 和 TEMED 外 的 所 有 在 表 抓 1 中的试剂，制备合适的分离胶单体溶液; 一次性塑料烧杯为较方便的混合容器。表 29.1 中提供了两种胶配方, 可满足通常所遇到的不同分子质量的需求。若想要制备其他浓度的丙烯酰胺凝胶 (Andrews，1986;Blackshear, 本系列;Hames,1981)，仅需调节配方中使用的 30% 单体储备液和水的用量。
在真空放置至少 15 min 以去除溶液中的气泡 (如放置于钟形玻璃器或干燥器中）。

(3) 温 和地将 APS 和 TEMED(表 29.1) 混勻人已除气的单体溶液中。利用移液器和吸耳球，将单体溶液加入到凝胶玻璃板间直到分离胶的界限处的标记。立刻在单体溶液上覆盖仲丁醇或叔戊醇的水饱和溶液以排除空气，防止空气存在于单体混合物表面带来的抗聚合作用。放 置 45 min〜 I h 待凝胶聚合。约 15 min 后覆盖层的下方会开始出现很明显的界面，证明聚合作用的发生。本质上说，聚合作用约 90 min 才可完成，然 而 1 h
后就可以将积层胶倒入 (Bio-Rad Lab,Bull.No.1156)。没用完的单体在烧杯中聚合后丢弃凝胶。

⑷ 制 备 10 m L 积层胶单体溶液 (4% t 、2. 7 % C ), 混合如下成分:

水 6.1 m L

0.5 m o l / L Tris-H C l ,p H 6. 8 2.5 m L

丙烯酰胺储备液 ( 3 0 % T ) 1.3 m L

1 0 % S D S 0.1 m L

真空放置至少 15 m i n 以排除单体溶液中的气泡。

(5) 用水彻底冲洗分离胶的顶部，并在此上方放置滤纸吸干水分。在凝胶玻璃板间放置形状良好的齿梳，使之倾斜微小角度以使气泡顺利逸出。

(6) 在 每 10 m L 除气单体溶液中加入 50 A 1 0 % A P S 和 10 A T E M E D ，将积层胶溶液倒在分离胶的顶部。使齿梳在其适当位置排成一行，注意不要将气泡困人齿部的下端 。可见的积层胶聚合作用应该在约 10 m i n 内发生。因为齿梳已经将氧气从齿孔的表面排除出去, 故不再需要任何覆盖物。放 置 30〜45 m i n 待凝胶聚合。没用完的单体在烧杯中聚合并丢弃。

某些时候，可能需要将凝胶放置过夜再使用。在这种情况下，为维持两种凝胶之间界面离子的不连续性，最好在使用凝胶之日再倒入积层胶。保存时, 应彻底清洗分离胶的顶部并覆盖分离胶缓冲液 (0.375 m o l / L Tris-H C K O .1 % S D S ,p H 8. 8)，以防止凝胶脱水和离子损耗。同时，保存过程中凝胶连同夹板的顶部也需用塑料膜包裹。

5. 样品制备

因常用生化缓冲液通常可耐受 S D ^ P A G E ，故样品一般不需要经过预处理。带型变形 ，如条带的收缩或扩张, 可能是样品中盐成分过多而引起的。对样品进行脱盐处理可以补救这些变形现象。

(1) 制备待测样品所需量的 S D S -还原缓冲液，每 0.95 m L 样品储备缓冲液中加人50ul 2-巯基乙醇 (2-巯基乙醇的终浓度为 5 % ) 。

(2) 用 至 少 4 倍体积的完全 S D S-还原缓冲液对样品进行稀释 (尽管对于有些样品而言 ，用 2 倍体积稀释已经足够）。样品量视孔的宽度及凝胶的厚度而定, 常规凝胶加样量为 20〜50uL ，迷你胶加样量为 5〜30 uL 。为使染色时条带易见，每个条带应加人约 I ug(考马斯亮蓝 R -250 染 色 ) 或 0.1ug(银染）的蛋白质 (见下文）。

(3) 将装有样品的试管悬置于热水浴中，95°C 加热稀释后的样品 4 m i n 。不要保存制备好的样品。

6. 电泳

装配电泳仪，将电泳缓冲液加入到上层和下层池中，移除积层胶中的齿梳。利用微量进样器或微量吸移管将制备好的样品装载人积层胶的孔中, 使其在电泳缓冲液底部成层。样品中的甘油为样品下沉至孔底提供了必要的密度条件，溴酚蓝示踪染料则使样品上样过程可见。最后 ，将导线连到电泳装置上，并接通电源。 S D S -P A G E 中，下层电极为阳极 ，上层电极为阴极。

在电泳过程中，电能会转化成热能并导致条带变形和扩散。通常, 电泳时会在电泳槽散热能力允许的范围内选择一个能使电泳运行尽可能迅速的电压。换言之，在不影响理想分离效果并不导致条带变形的前提下，电泳速率越快越好。

许多可用电源都能控制电量, 选择时大多只是一种偏好的问题 。 一 般说来, 恒定电流会比恒定电压电泳时间更短，但产热更多 (Alien et al. ，1984)。电泳初期，随着氯离子的迁出凝胶的阻力会增大。因此, 使用恒流电泳时电压会上升, 而恒压电泳时电流会下降。

在电泳开始初期高电流产生的热量的驱散方面, 拥有薄玻璃板的小版电泳棺比常规大小的槽表现得更有效率。因此，我们建议凝胶在常规电泳设备中采用恒定电流（16〜24 m A /m m 凝胶厚度），而在迷你电泳设备中采用恒定电压（2 〇 〜30 V /c m 凝胶长度）。还可使用再循环冷却剂以达到提高电压和电流来缩短电泳时间的目的。上样后应立即开始电泳，通常电泳持续至溴酚蓝示踪染料到达凝胶底部。

7. 对 于 方 法 的 评 注

L a e m m l i 的 S D S - P A G E 方 法（Alien et al. ，1984; A n d r e w s ，1986; Blackshear, 本系列 ；H a m e s ，198 1 ;L a e m m l i ，1970) 是早前 Ornstein( 1964) 和 Davis(1964) 应用于分离天然血清蛋白质方法的改进版。 Ornstein-Davis 系 统（Ornstein, 1964; Jovin，1 9 7 3 ) 中积层胶和分离胶中使用的缓冲液是不同的 (非连续的），这是该系统正常运行所需的。然 而 ，S D S的加人对 O m s t e i n -Davis 技术基本原理做了重要修改，因为这种去污剂的特质支配了整个系统（Allen et al. ,C h r a m b a c h ,1 9 8 5 ; Wyckoff et al. ，1 9 7 7 ) 。

L a e m m l i S D S- P A G E 系统的必要组分包括 T r i s - H C l 凝胶缓冲液、Tris-甘氨酸- S D S电泳缓冲液及 S D S 还原型样品缓冲液。在 系 统 中 加 人 S D S 后, 在配制积层胶时实际没有必要采取与分离胶不同的 p H 和离子强度。积层胶配制时，无 论 条件是如 上 所 述还是采用分离胶缓冲液 (0.375 m o l / L T r i s - H C U p H 8. 8 ) ，都可以观 察 到 相似的分辨率。这 是因为在此范围内 S D S ■多肽复合物的运动对 p H 是不敏感的 (Allen et al. ,1984)。 当一次配制许多凝胶以保存日后使用时，对于积层胶和分离胶采用相同的缓冲液就显得非常方便。

另 外 ，S D S 的完全加入对分辨率的影响非常大（W y c k o f f et al. ,1977)。微型电泳装置中, 在 30〜50 样品中加入 200 F g 以上的 S D S 可以使蛋白质条带扩宽和摊开。对稀释的、大容量的样品，通过将处理样品中的 S D S 终 浓 度 降 至 0. 5 % ，并且制备凝胶过程中不加 S D S ，将有利于限制系统中 S D S 的总量。 因 为 S D S 迁移率大于蛋白质的迁移率，故电泳时电泳缓冲液中的 S D S 很快超过蛋白质。 因 此 为 了 将 S D S 维持在足够饱和蛋白质的水平上，凝胶必须可以从电泳缓冲液中得到 不 断 补 充 的 S D S (C h r a m b ac h ，1 9 85)。

8. 方 法 的 变 更

L a e m m l i S D S - P A G E 系 统（Allen et al. ,1984; A n d r e w s ,1986; Blackshear, 本 系 列 ；H a m eS，1981;L aem m l i ，1970) 中，完全变性分解的蛋白质并不总是最合适的。对于某些分析，人们所感兴趣的可能是测定个别完整的、低聚体形式的蛋白质的分子质量。在其他的实验中，人们的兴趣集中于天然的非变性状态的蛋白质的生物活性。通 过 2-巯基乙醇和 S D S 这两种变性剂的选择，可以根据需要调节条件以分离出完全变性的、部分变性的或 天 然 状 态 的 蛋 白 质 。

移除样品缓冲液中的 2-巯基乙醇，可以维持蛋白质亚基间的共价连接。若不加人还原剂 ，样品蛋白质的链内或链间二硫键可保持完整。由此生成的 S D S -蛋白质复合物的电泳迁移率较之那些在解离条件下获得的复合物会有相应改变。电泳时，寡 聚 S D S 蛋白质的迁移率低于其完全变性的 S D S -多肽组分的迁移率。此外，单链多肽的电泳行为同样受到还原剂的影响。单链蛋白质的链内二硫键可以保持其紧密构象，在 S D S 存在的情况
下 ，这种紧密构象能够或多或少地被保持下来。因此电泳时 ， 一 些 不 加 2-巯基乙醇的S D S 蛋白质比加入还原剂导致结构伸展的蛋白质迁移速率更快。蛋白质通常会对还原剂表现出独特的反应，故通过比较含有或不含 2-巯基乙醇的 SDS-P A G E 可以了解到很多信息（Marshall，I984)。

为 了 不 加 还 原 剂 而 分 离 蛋 白 质 ，可 以 制 订 上 述 S D S —— P A G E 步 骤 ，并 且 无 需 在 样 品 缓冲 液 中 加 人 2-巯 基 乙 醇 。需 要 注 意 的 是 ，寡 聚 S D S -蛋 白 质 复 合 物 比 其 S D ^ 多 肽 亚 基 迁移 得 更 慢 。因 此 ，为 使 寡 聚 物 在 介 质 中 移 动 适 当 的 距 离 , 可 能 有 必 要 使 用 比 采 用 全 变 性 方法 时 更 低 浓 度 (％ T ) 的 胶 。此 外 ，未 还 原 的 蛋 白 质 可 能 不 会 被 S D S 完 全 饱 和 ，因 此 ，这类蛋 白 质 可 能 不 会 以 恒 重 比 率 结 合 该 去 污 剂 。这 使 得 应 用 S D ^ P A G E 方 法 测 定 这 类 分 子的 分 子 质 量 不 如 测 定 完 全 变 性 的 多 肽 的 分 子 质 量 明 确 ，因 此 ，蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 与 未 知蛋 白 质 必 须 构 象 相 同 ，才 能 进 行 有 效 的 比 较 。

将 L a e m m l i 法 中 的 S D S 和 2-巯 基 乙 醇 移 除 , 就 成 为 用 于 检 测 天 然 蛋 白 质 的 经 典◦ rnstein-Davis P A G E 法 ① avis, 1964; 〇 rnstein, 1964)。这 是 一 种 为 了 将 血 清 蛋 白 质 全谱 都 分 离 出 来 而 设 计 的 髙 分 辨 率 天 然 P A G E 方 法 。因 为 这 种 体 系 意 在 广 泛 地 分 离 各 种蛋 白 质 ，其 分 辨 率 并 不 适 用 于 某 些 蛋 白 质 迁 移 的 限 定 范围。 尽 管 存 在 一 些 可 满 足 不 同 需求 的 高 分 辨 率 天 然 P A G E 系 统（Allen et al,1984; Andrews ,1986 ;Blackshear, 本 系 列 ；C h r a m b a c h , 198 5 ;H a m e s , 1981), 但 Ornstein-D a v i s 法 足 够 适 用 于 大 多 数 通 常 遇 到 的 蛋白 质 混 合 物 的 分 离 。 由 于 单 一 的 天 然 系 统 不 能 区 分 蛋 白 质 电 泳 运 动 时 电 荷 与 构 象 因 素 的效 应 ，天 然 P A G E 法 比 S D S -P A G E 法 更 加 难 以 测 定 分 子 质 量 。

这 里 所 述 的 步 骤 对 天 然 P A G E 法 做 了 较 简 易 的 修 改 。仅 仅 是 移 除 了 样 品 缓 冲 液 中的 2-巯 基 乙 醇 ，并 将 凝 胶 、样 品 和 电 泳 缓 冲 液 配 方 中 的 1 0 % S D S 换 成 等 体 积 的 水 。除样品 处 理 外 , 如 未 特 别 指 出 ，则 按 照 前 述 步 骤 进 行 。样 品 应 该 在 非 变 性 缓 冲 液 [〇. 〇 6 m 〇 l/LT r i s - H C K p H 6. 8 ) 、1 0 % 甘 油 、0•0 2 5 % 溴 酸 蓝 ] 中 稀 释 ，遵 循 变 性 凝 胶 电 泳 时 样 品 制 备 的准 则 ，但 样 品 不 加 热 。

二、凝 胶 中 蛋 白 质 的 检 测

我 们 提 供 了 3 种 最 简 单 和 最 可 靠 的 用 于 检 测 S D S -P A G E 凝 胶 中 蛋 白 质 的 方 法 ，它们完 全 能 够 满 足 大 部 分 情 况 的 需 要 。考 马 斯 亮 蓝 R -2 5 0 是 最 常 用 的 蛋 白 质 染 色 剂 ，也 是 常规 实 验 中 的 推 荐 之 选 。银 染 法 是 凝 胶 中 蛋 白 质 染 色 的 最 敏 感 方 法 ，当 使 用 电 泳 评 估 制 备纯 度 时 (如 在 抗 原 制 备 时 ) 应 采 用 此 法 。铜 染 法 是 近 期 发 展 起 来 的 迅 速 且 灵 敏 的 染 色 方法 。对 于 其 他 检 测 方 法 的 讨 论 , 包 括 放 射 性 标 记 及 凝 胶 中 蛋 白 质 的 定 量 方 法 ，也 可 以 由D u n b a r d 987)、Andrews(1986) 、 Alien 等（1984)、Hames(1981) 和 Merril(本书）等所著文献中了解到。

电泳结束之后，移除凝胶装置，分开玻璃板。凝胶可能会粘在其中一块玻璃板上。移除间隔条，切除并丢弃积层胶。将带有胶的玻璃板放人固定液或着色液中, 使凝胶漂离玻璃板。凝胶着色的所有步骤都必须在室温下适当的容器 (如玻璃皿或洗照片用的托盘) 内温和搅动进行 (如放在定轨摇床平台上方）。由于指纹会沾染，故在凝胶染色时总需要戴上手套。通过对凝胶拍照，或将其放置于滤纸上并利用市场上可买到的干燥器进行干燥处理 ，便可获得已染色凝胶的永久性记录。

1。 考 马 斯 亮 蓝 R - 2 5 0 染色

考 马 斯 亮 蓝 R - 2 5 0 染 色 是 蛋 白 质 检 测 的 标 准 方 法（Allen et al. ,1984 ;Andrews,l986;H ames，1981;W ilson，本 系 列）。若 要 使 蛋 白 质 条 带 较 易 观 察 ，每个条带需含0.1〜 I ug 蛋白质。

(1) 制备染色液： 将 0. 1 % 考马斯亮蓝 R -250(m “ ) 溶 解 于 4 0 % 甲醇 (V /V )、1 0 % 乙酸中 (V /V )。当染料溶解后过滤染色液。染色液可重复利用。室温保存。

(2) 使用过量的染色液浸泡凝胶，时间为 30 m i n 。

(3) 使用大量过量的 4 0 % 甲醇、1 0 % 乙酸进行脱色。脱色液需更换几次，直到背景色的移除已让人满意。

该步骤中所使用的酸性乙醇溶液并不完全能固定凝胶中的蛋白质。这会造成在薄凝胶染色和脱色时一些低分子质量蛋白的损失。故在凝胶浸人染色液之前，若先将其放置在 4 0 % 甲醇 (V /V )、1 0 % 三氯乙酸 (m /V 冲 衅 育 I h , 即可得到永久的固定效果。

2. 银 染 法

这种方法由 Merril和其同事发明,其灵敏度可比染料染色法高1 00倍以上（Allenet al.，1984 ;Merrii et al. ,1981，本系列），容易观察到那些含有 10〜100 ng蛋白质的条带 。试剂可从 Bio-Rad Laboratories 公司的试剂盒中获得。

反应时间随凝胶厚度而改变。

(1) 在 400 m L 40% 甲醇、1 0 % 乙酸 (V /V )(或 4 0 % 甲醇、1 0 % 三氯乙酸）中对凝胶中的蛋白质进行固定，时间可为 30 m i n 至过夜。

⑵ 在 400 m L 1 0 % 乙醇、5 % 乙酸 (V /V ) 中固定凝胶两次, 时间为 15〜30 m i n 。

(3) 将 凝 胶 浸 泡 于 200 m L 新 鲜 的 氧 化 剂 溶 液（0.0034 m 〇 l/L 重 铬 酸 钾 、0.0032m o l / L 硝酸) 中 3〜10 m i n 。

(4) 用 400 m L 水洗凝 胶 3 次 或 4 次 ，每 次 5〜10 m i n ，直到黄色被洗去。

(5) 将凝胶浸泡在 200 m L 新鲜银试剂 (0•012 m o l /L 硝酸银) 中 15〜30 m i n 。

(6) 用 400 m L 水 洗 凝 胶 1〜2 min。

(7) 用 显 影 剂（0. 28 m o l / L 碳 酸 钠 、1. 8 5 % 多 聚 甲 醛 ) 洗 凝 胶 I m in 。

(8) 更换新鲜的显影剂, 孵育 5 m m 。

(9) 再一次更换显影剂，等待显影直到获得满意的染色结果。

(10) 用 5 % 乙酸 (V/V) 停止显影。

有时在银染凝胶中 50〜70 kDa 区域内可看到垂直条痕和独立于样品的条带。这些伪迹是不慎引入样品的污染物的还原反应所造成的 (Pchs1983)。在对样 品 进 行 SDS-还原缓冲液处理后，再加人过量的碘乙酰胺, 便可消除这些伪迹。

3. 铜 染 法

迅速、单 步 式 的 SD^ PAGE 凝 胶 染 色 法 可 通 过 将 凝 胶 浸 入 氯 化 铜 中 来 完 成（Leeetal.,1987)。其染色结果，即电泳图中负染图像在灵敏度方面介于考马斯蓝和银染之间。

(1) 用水简单清洗凝胶。

(2) 将凝胶浸泡于 0.3 mol/L CuCl2 5 min。

(3) 用水清洗凝胶 2〜3 min。

这种方法表现结果为负染凝胶, 即在不透明的蓝绿背景中显示出清晰的蛋白质条带。蛋白质条带很容易观察到，并可在黑色表面上进行凝胶显影。采用此方法时, 蛋白质并非永久固定，其可在螯合铜之后被定量洗脱 (Lee et al. ，I987)。当铜染凝胶变干燥时，其电泳图案会丟失。故必须及时拍照，采用考马斯亮蓝复染或储存在水中。

三、蛋 白 质 分 子 质 量 标 准

蛋白质分子质量标准混合物可用于凝胶标定。 p a g e 标准物是一些分子质量精确已知的蛋白质混合物经统一染色混合而成。它们处于不同分子质量范围。在电泳之前标准物浓缩储备液在样品缓冲液中稀释，并以和样品蛋白质相同的处理方式进行处理。这些蛋白质用做分子质量检测的参考标准。

近期预染 SDS——PAGE 蛋白质分子质量标准开始得以使用。染料分子与蛋白质分子质量标准品的结合使得它们的分子质量发生较大且难以预测的改变，故它们不能应用于分子质量检测。然 而 ，预染蛋白质分子质量标准在追踪电泳过程时非常有用，并且在凝胶印迹时评价蛋白质转移效率方面很有价值。

四、分 子 质 量 测 定

蛋白质分子质量的测定可通过将其与若干分子质量已知的蛋白质分子质量标准进行迁移率比较而完成。在凝胶电泳完成后，染色之前，标记出溴酚蓝示踪染料的位置，以鉴定出电泳离子界面的前沿。这些可以通过在凝胶边缘切口或者将在印度墨汁中浸泡过的针头插入凝胶中染色前沿实现。染色之后，测量每种蛋白质 (蛋白质标准品或未知蛋白质) 从分离胶顶部的迁移距离。用每种蛋白质的迁移距离除以追踪染料的迁移距离，从而得到的标准化的迁移距离，称为蛋白质的相对迁移 (相对于染色前沿），通 常 以 风 表 示 。建立蛋白质标准品分子质量对及值函数的 (半) 对数图。注意图案微呈 S 形 。只要不是分子质量范围的极限值，均可以通过 log MT对Rt的曲线作图进行线性回归分析或插值法分析来估算未知分子质量。需要牢记的是，通 过 S D S ——P A G E 得出的分子质量是那些多肽亚基的分子质量，而不是那些天然的寡聚蛋白质的分子质量。

五、制 备 型 电 泳

最令人满意的回收 S D S P A G E 分离的蛋白质以进一步研究的方法是从凝胶中切除出条带并提取蛋白质。人们做了很多尝试以设计出适合常规蛋白质纯化的连续洗脱设备 ，在这些设备中，电泳凝胶底部出现的条带被溜分收集器带走 。制备型凝胶设备的稀缺显示出在发展通用型的有用设备方面缺乏成功案例。理想的制备型凝胶电泳应该能够产出高水平毫克乃至克级单体的蛋白质，使蛋白质从相应的分析型凝胶的分离物中纯净地恢复出来。然而，总体来说，条带变形和较差的洗脱限制了大多数仪器所能达到的分辨率, 使得它们只有在用于相对较简单的蛋白质混合物时才有较好的效果。将凝胶电泳扩大至制备水平的种种困难导致了设备的笨重，也使得在追求最好的结果时需要大量专门的技术。因此, 蛋白质一般都经分析型凝胶分离而获得 (Harrington, 本书）。

以蛋白质分离为目的而使用的凝胶在制备时可使用特殊的制备型齿梳 (A n d r e w s ,l986;C h ra m b ach ，1985)。这些宽样品孔齿梳横跨了整个凝胶的宽度, 并通常为蛋白质标准品提供一个独立狭窄的参照孔。凝胶的最大样品上样量最终取决于感兴趣的蛋白质从样品混合物中与相邻蛋白质分离开的效果好坏。由于随着用样量的增加条带会变宽，故随着样品上样量增多，分离时相应分辨率的损失终究会变得难以接受。与分析型凝胶相
比，制备型凝胶中每单位横截面的蛋白质上样量多 10〜5 0 倍属允许范围。因此, 使用一些大平板凝胶时，数十毫克的蛋白质均可得以回收。

因为不需要固色剂，铜染法是一种在制备型 S D S ——P A G E 中可以使条带可视化的可取方法。将目标条带从凝胶中切除下来，浸 泡 在 0•25 m o l / L E D T A 、0. 25 m o l / L Tris-HCl( p H 9) 的溶液中进行脱色，溶液需更换 3 次 (每 次 10 m i n )。脱色之后，将凝胶切片浸泡入适当的洗脱缓冲液中。

蛋白质通常通过简单扩散作用进入适当的缓冲液或通过凝胶的溶解作用（A n d r e w s ,l986 ;Harrington，本书） 自浸泡的凝胶片中抽提出来。在后一种方法中，不同于双丙烯酰胺的交联剂被聚合人凝胶中（Allen et al, ,1984 ;A n d r e w s ，1986)。例 如 ，与 N ,N ‘-双 (丙稀酰) 胱胺 (N ，N ‘-bisacrylylcystamine，B A C ) 相交联的凝胶在 2-巯基乙醇或二硫苏糖醇中可溶，与 N ， 一■轻基乙稀双丙燔酰胺 (N ,A ^-dihydroxyethylenebisacrylamide,D H E -B A ) 和 JV，N -酒石酸双丙稀醜胺（] V ，N 7〜diallyltartardiamide，D A T D ) 相交联可使凝胶在高碘酸中可溶。一旦凝胶溶解, 就必须通过凝胶过滤或离子交换色谱法将蛋白质从过剩的凝胶介质中分离出来。

电泳洗脱是一种能从凝胶切片中恢复蛋白质的有效方法。此方法最简版中，采用凝胶柱状电泳的设备，使蛋白质受电泳作用脱离凝胶切片，并进入透析袋。设备可以进行小量迅速的蛋白质回收, 并且在大部分情况下产量要高于 7 0 % 。洗脱时大约需要 3 h ，在 0•025 m o l / L Tris、0. 192 m o l /L 甘氨酸、〇. l% S D S ( p H 8. 3) 的溶液 (标准 S D S ^P A G E 电泳缓冲液) 中以 10 m A /管进行。通过透析或离子交换色谱法可以移除洗脱后样品中的 S D S (F u r t h ，1980)。