单向琼脂扩散试验（Single immunodiffusion test）

互联网2013-09-05

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可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。

单向琼脂扩散试验（Single immunodiffusion test）―人血清中IgG、IgA、IgM的测定。 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。本试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量。

【材料】 IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器（10微升）、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。 【方法】 1、免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂（用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成），加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清（抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度），混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。 2、稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。 <img height="114" src="http://www.bioon.net/experiment/uploadfiles/200612/20061223155625239.gif" width="489" /> 3、加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。 4、扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，（如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察），必要时可以染色后观察。 5、绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法： （1）Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K（C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数）。 （2）Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间（24小时）扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K（C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数）。 <img height="168" src="http://www.bioon.net/experiment/uploadfiles/200612/20061223155626797.gif" width="360" /> 【结果】免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批号的参考血清其免疫球蛋白含量不一。