单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（图）

可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。

根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。即：环状沉淀反应（ring precipitation reaction），凝胶中沉淀反应（precipitation reaction in gel），如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应（flocculation precipitation reaction），如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。

（一）单向免疫扩散（Single immunodiffusion）——人群血清IgG正常值测定

一、基本原理

在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或U/ml）。

应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。

二、实验材料

2%离子琼脂或生理盐水琼脂（采用0.9%的生理盐水，内含0.1% NaN3）。
　　标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
　　工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）
　　PBS （pH7.2，0.01M）.
　　打孔器（孔径3mm）及打孔模板
　　微量加样器
　　湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
　　已制备好的含有1%马抗人IgG抗体的琼脂板
　　稀释的单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50）

三、实验方法

（一）标准曲线的制备：示教
　　1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4ml，在分装2%盐水琼脂时即为2ml。溶化后置56℃~60℃水浴中平衡温度备用。
　　2．稀释抗体，用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
　　3．制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃~60℃的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。
　　4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。
　　5．稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80及1/160。
　　6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
　　7．将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。
　　8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。