单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（图）

可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。

根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。即：环状沉淀反应（ring precipitation reaction），凝胶中沉淀反应（precipitation reaction in gel），如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应（flocculation precipitation reaction），如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。

（一）单向免疫扩散（Single immunodiffusion）——人群血清IgG正常值测定

一、基本原理

在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或U/ml）。

应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM的水平。

二、实验材料

2%离子琼脂或生理盐水琼脂（采用0.9%的生理盐水，内含0.1% NaN3）。
　　标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）
　　工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）
　　PBS （pH7.2，0.01M）.
　　打孔器（孔径3mm）及打孔模板
　　微量加样器
　　湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）
　　已制备好的含有1%马抗人IgG抗体的琼脂板
　　稀释的单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50）

三、实验方法

（一）标准曲线的制备：示教
　　1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需1%离子琼脂4ml，在分装2%盐水琼脂时即为2ml。溶化后置56℃~60℃水浴中平衡温度备用。
　　2．稀释抗体，用pH7.2的PBS稀释标准抗人IgG抗体，终浓度为抗体效价的一倍。例如，血清效价为1/140，原浓血清即应按1/70稀释。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
　　3．制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃~60℃的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1-2次，将抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。
　　4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。
　　5．稀释不同浓度的标准参考蛋白（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1/10、1/20、1/40、1/80及1/160。
　　6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。
　　7．将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。
　　8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。

（二）人血清中IgG正常值的测定：
　　1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。
　　2．将单位正常人血清用PBS分别作1/50稀释。
　　3．用微量加样器分别取1/50稀释的单人份血清标本10µl加入孔中，每份标本应各加两孔。 
　　4．作好标记放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。

四、实验结果

测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的量（U/ml），并换算为mg/ml。统计全实验室实验结果并计算出均值，写出较完整的实验报告。
   

单向免疫扩散示意图

五、注意事项

1．在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

2. 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。

（二） 双向免疫扩散（Double immunodiffusion）——抗原分析

一、基本原理

双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及位置可了解抗原或抗体的若干性质，如浓度、特异性等。

二、实验材料

1%琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml
　　载玻片
　　打孔器及打孔模板
　　微量加样器及塑料吸头
　　抗原：0.5µg/ml牛血清白蛋白（BSA）、0.5µg/ml人血清白蛋白（HSA）
　　抗体：兔抗人血清白蛋白加兔抗牛血清白蛋白
　　湿盒

三、实验方法

1．将已溶化的1%盐水琼脂管放58℃～60℃水浴箱中平衡温度备用。

2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5～4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板（注意：倾注速度不要过快，以免琼脂溢出载玻片；倾注过程要连续以保证琼脂板均匀、平滑）。

3．琼脂凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次试验采用三角型（如图），即每三个孔组成一个三角型（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板，故根据其大小只能采用三角型且每一琼脂板也只能打孔两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，而制成三角型三组，因各孔相距过近，抗原、抗体相互渗透扩散将影响结果的判断）。

4．如图2所示，用微量加样器加10µl抗体于各组一孔中，每组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10µl。注意每加一样品均需更换吸头，以防止交叉污染，影响实验结果。

5．作好标记，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。

四、实验结果

1．融合性沉淀孤，说明两孔中抗原相同，为同一性反应（图2-1）。

2．两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应（图2-2）。

3. 融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同成分又有不同成分，此为部分同一性反应。
 

双向免疫扩散沉淀线（图2）

（三） 免疫电泳（Immunoelectrophoresis）——示教

一、基本原理

免疫电泳法是将凝胶电泳与双向免疫扩散两种技术相结合的一种实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽，将抗体加入沟槽内，使抗原与抗体相互扩散而形成沉淀线。根据沉淀线的数量、位置及形状，分析标本中所含各组分的性质，本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。

二、实验材料

1%离子琼脂（pH8.6巴比妥缓冲液加入等量蒸馏水，再加入1%琼脂。溶解后用脱脂棉过滤，分装，实验前加热溶解置56℃-60℃水浴箱中平衡温度备用）。
　　免疫电泳用玻片
　　待检血清
　　人IgG（1mg/ml）
　　抗人全血清抗体（购自北京中山公司）
　　微量加样器及塑料吸头
　　尖吸管及橡皮吸头
　　打孔器、解剖刀、尺、打孔模板、湿盒等。
　　电泳仪：将pH8.6巴比妥缓冲液注入电泳槽内（注意正负极各槽内所加入的量应在同一水平）。并将滤纸裁至适当长度和宽度以备搭桥使用。

三、实验方法

1．将溶化的1%离子琼脂倾注于玻片上制成琼脂板。
　　2．琼脂板冷却凝固后，按照模板于挖槽线上下两侧各打一个孔，并分别用微量加样器加入待检血清及人IgG各15ul。
　　3．将琼脂板置于电泳槽内，注意电泳标本应放负极“―”一侧。并将已浸透缓冲液的滤纸一端覆盖于琼脂板两侧各约0.5cm，另一端浸于电泳液中。
　　4．接通电源，电压、电流及电泳时间应视仪器性能而定。一般电势梯度6 V/cm，电流每板20mA，泳动时间1～2小时。
　　5．电泳完毕，关闭电源，取出琼脂板，按模板位置用解剖力挖横槽。用特制尖吸管加入抗人全血清抗体。
　　6．将琼脂板置于湿盒中，于37℃温箱中扩散24小时。

四、实验结果

根据沉淀弧的位置及形状，参照免疫球蛋白迁移范围示意图，识别主要Ig。