单向定量免疫电泳
最新修订时间:
原理
火箭电泳(rocketimmunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电泳,将抗原样品放在含有专一性抗体的凝胶孔中,抗体静电荷为零不移动;而抗原分子在电场作用下移动,形成抗原-抗体复合物沉淀下来。后面的抗原继续向正极泳动遇到沉淀的抗原-抗体复合物,抗原过量使复合物沉淀溶解,与未结合的抗体结合,又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来,不断沉淀-溶解-再沉淀,最后形成锥形的沉淀峰,称火箭电泳。其高度与所加抗原的量大致成比例。
(来源:生物化学与分子生物学实验指导,邵雪玲等,武汉大学出版社,2003)
(来源:生物化学与分子生物学实验指导,邵雪玲等,武汉大学出版社,2003)
材料与仪器
人IgG 兔抗人IgG
琼脂
玻璃板 电泳仪 水平电泳槽 打孔器 微量加样器 恒温水浴锅
琼脂
玻璃板 电泳仪 水平电泳槽 打孔器 微量加样器 恒温水浴锅
步骤
1. 抗体琼脂板的制备
将融化的琼脂冷却到55 ℃,加入适量(看免疫血清的效价高低而定)的抗体,立即混匀(不要出现泡沫),将上述的抗体琼脂(大约20 ml)制成琼脂板,冷却后按下图打孔备用。
2. 加样
在各孔里加入按二倍连续稀释法稀释的抗原。
3. 电泳
通电后调电压为10 V/cm,或电流强度为2~4 mA/cm,时间约1~5小时。
4. 观察
在电场作用下,定量的抗原在含有定量的琼脂中泳动后,比例合适时,可在短时间内出现锥形沉淀,此沉淀线形似火箭,抗原浓度越高,“火箭”面积愈大。但抗体效价要高。
5. 定量抗原
在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后,测定沉淀峰的高度,用圆规仔细测量沉淀峰最尖端与样品孔中心间的距离,记录结果。以标准样品即不同抗原浓度为横坐标,以沉淀峰的高度为纵坐标绘制标准曲线。根据量得的待测抗原沉淀峰的长度,从标准曲线查出相应抗体含量,在乘以样品稀释倍数即可计算出该抗原的含量。
将融化的琼脂冷却到55 ℃,加入适量(看免疫血清的效价高低而定)的抗体,立即混匀(不要出现泡沫),将上述的抗体琼脂(大约20 ml)制成琼脂板,冷却后按下图打孔备用。
2. 加样
在各孔里加入按二倍连续稀释法稀释的抗原。
3. 电泳
通电后调电压为10 V/cm,或电流强度为2~4 mA/cm,时间约1~5小时。
4. 观察
在电场作用下,定量的抗原在含有定量的琼脂中泳动后,比例合适时,可在短时间内出现锥形沉淀,此沉淀线形似火箭,抗原浓度越高,“火箭”面积愈大。但抗体效价要高。
5. 定量抗原
在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后,测定沉淀峰的高度,用圆规仔细测量沉淀峰最尖端与样品孔中心间的距离,记录结果。以标准样品即不同抗原浓度为横坐标,以沉淀峰的高度为纵坐标绘制标准曲线。根据量得的待测抗原沉淀峰的长度,从标准曲线查出相应抗体含量,在乘以样品稀释倍数即可计算出该抗原的含量。
注意事项
如果精确计算,可用求积仪测定峰的面积。影响单向定量免电泳的因素很多,主要是要选择好抗体浓度,使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量,如效价高,则免疫血清琼脂的比例为1∶5~9,如效价低;;则免疫血清与琼脂的比例为2∶5。另外,抗原含量也要注意,过高过低都影响火箭峰形。如抗原含量过低,则峰形太矮,如抗原浓度过高,则火箭峰不封口。如抗原抗体量合适,泳动的距离大约为2~5 cm。
来源:丁香实验