蛋白质双向电泳

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【目的和要求】
1、 学习和掌握蛋白质双向电泳的基本原理和方法。
2、 了解双向电泳技术在蛋白质组 学研究中的应用。
【实验原理】
蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE），按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
等电聚焦是一种特殊的聚丙烯酰胺 凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。这个过程称作等电聚焦蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能段裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂则能使半光氨酸残基之间的二硫键段裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异。因此这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
蛋白质双向电泳是将蛋白质等电点和分子量两种特性结合起来进行蛋白质分离的技术，因而具有较高的分辨率和灵敏度，已成为蛋白质特别是复杂体系中的蛋白质检测和分析的一种强有力的生化手段。

【实验器材和试剂】
1、凝胶原液（28.38%Acr +1.62%Bis）。
2、TEMED原液。
3、过硫酸铵。
4、pH3.5～10、pH4～6、pH6～8两性电解质载体。
5、尿素。
6、10%非离子去污剂NP-40。
7、50mmol/L NaOH；。
8、25mmol/LH3PO4 。
9、SDS。
10、60mmolTris-Cl pH6.8。
11、2-巯基乙醇。
12、10倍SDS-PAGE电极缓冲液（0.25mol/L Tris-HCl,1.92mol/L 甘氨酸，1%SDS）。
13、0.05%溴酚蓝。
14、1%琼脂。
15、蛋白质抽提液（30mmol/L Tris-HCl pH8.0,0.1mmol/LMgCl2,6mmol/L抗坏血酸，1%PVP，5%甘油，0.02% 2-巯基乙醇）。
16、丙酮。
17、研钵，石英砂，烧杯，试管，玻棒，量筒。
18、双向电泳槽一套（包括圆盘电泳槽和垂直板状电泳槽等），电泳仪。