蛋白质技术——双向电泳
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实验试剂
Acetic acid、 EtOH、 CBB、 琼脂、 丙烯酰胺SDS 等
样品提取液Ａ：10%三氯乙酸,0.07%β-疏基乙醇的丙酮溶液
样品提取液Ｃ：9.5mol/Ｌ尿素,2%NP-40,2%Ampholine (1.6%pH5～8,0.4% pH 3.5～10),5%β-疏基乙醇
丙烯酰胺液Ｄ：28.38%丙烯酰胺,1.62%甲叉双丙烯酰胺
凝胶平衡液Ｅ：10%甘油,0.1%β-疏基乙醇,4%SDS,0.1mol/ＬTris-HCl pH 6.8)
分离胶缓冲液Ｇ：1.5 mol/ＬTris-HCl (pH 8.8),0.4% SDS
浓缩胶缓冲液Ｈ:0.5mol/ＬTris-HCl (ｐＨ6.8),0.4% SDS
电极缓冲液Ｉ：1% SDS,3.22% Tris,14.1%甘氨酸
实验步骤
2．溶解分离胶溶液和过硫酸铵溶液。必须监控凝胶溶液的温度，因为高温下（大于25℃）聚合作用太快。
3．分离胶溶液除气4分钟，在桌子边缘轻弹玻璃管壁，避免产生气泡。
5．用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分离胶溶液中，溶液应小心摇晃，避免氧气进入胶内。
6．将分离胶溶液加到两个凝胶灌注装置的每一个充填船里（每4个管700μl）。所有的玻璃管末端都必须浸没于凝胶溶液中。
9．使用一个Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝胶溶液中，轻轻振荡使之混匀。
10．在两个凝胶灌注装置的每个充填船中的空余分隔室内加入200μl帽凝胶溶液；凝胶溶液应到达17mm的标记。
11．移去充填船，允许凝胶溶液到达13mm的标记。经过这一步，有空气进入管子底端和4mm标记处。
2．融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl两性电解混合液到100mg Sephadex胶中，在涡旋器上充分振荡10～15分钟。
3．从凝胶灌注装置移走凝胶管，把它们插入聚焦槽的阳极部分，仍应看到13mm标记。帽凝胶一端朝上。
4．将阴极溶液加入管子的阴极一边，不要有气泡（事先已除去水）。
5．将聚焦槽的阳极部分安放到聚焦槽的底部，管子必须浸入阴极溶液。
6．除去水，并将加样侧干燥。使用一个伸长的巴斯德移液管或凝胶装填移液管头将水吸去，然后用滤纸条将凝胶表面干燥。
8．用凝胶装填移液管头，迅速在胶上覆盖大约2mm厚的Sephadex。
9．用一个凝胶装填移液管头，装入样品（1～15μl），加到Sephadex表面。加样时，尖端必须接触Sephdex表层，样品应小心加入，避免气泡。
10．使用凝胶装填头，轻轻在样品上加入5μl覆盖液并分层，不要使覆盖液和样品相混合。然后在毛细血管中加入阳性溶液，不要引入气泡。
1．融解平衡溶液（在IEF结束前1小时）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。
7．IEF之后，如果凝胶并不立刻使用，应倒出平衡缓冲液，并在Petri盘中－70℃保存。－20℃保存导致分辨率降低；液氮保存将破坏凝胶。
3．喷洒70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干净。
6．在小玻璃板底部起6.9cm处做标记，做为加样得辅助（凝胶长度为6.6cm）。
7．将凝胶“三明治”装置夹到灌装支架上，旋钮向内，“尖角”向上。在有机玻璃板上加压以使凝胶三明治插入小突起下面。
8．将18ml凝胶溶液和1.2ml APS相混合，不要有气泡。溶液必须混匀，不要引进氧气。
9．含有凝胶溶液得容器放在加样槽的后面玻璃板上，这样凝胶溶液可以沿着加样槽从玻璃板流下而没有气泡，分离胶被加到标记处。
10．迅速用去离子水覆盖凝胶溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝胶一端用一巴斯德移液管防止搅动凝胶溶液，并使水在凝胶表面均匀地分层。60分钟后，凝胶可以用于SDS-PAGE电泳。
2．将凝胶“三明治”放到电极装置上（旋钮冲外，尖角向上）：首先将凝胶“三明治”放到电极装置的上面部分，向电极装置挤压它使下面一部分固定。
4．使用Pasteur移液管，将加样槽加满40℃的琼脂糖溶液（没有气泡），2分钟后，琼脂糖溶液应凝固。
5．在电极装置装入凝胶“三明治”以后，将Bio-Rad槽注入620ml电极溶液，加溶液的时候避免泡沫和气泡的形成。内槽中电极缓冲液面应到达电极装置中红塑料点的位置。
1．在将槽封闭之前，需要确定有机玻璃表面是否干燥，以避免形成“渐进”电流，凝胶表面必须覆盖电极缓冲液。
2．电压必须如下表所示分段升高，电流和功率要调到电源的最大值。电流值如表所述并在每一部内逐渐减小。在给定的时间间隔初始和结束的数值如下表所示：
3．SDS-PAGE结束之后，倒出电极缓冲液，从电极装置中取出凝胶“三明治”。轻微地弯曲隔板，将小玻璃板拉开以取出凝胶。凝胶可以转移到固定溶液中。
注意事项
