材料与仪器
蛋白质
十二烷基麦芽糖苷 阳离子去垢剂 尿素贮存液 尿素-硫脲贮存液
超速离心机 IPGphor 装置
十二烷基麦芽糖苷 阳离子去垢剂 尿素贮存液 尿素-硫脲贮存液
超速离心机 IPGphor 装置
步骤
3.1 用于 IEF 的蛋白质样品在尿素中的溶解
1. 固体样品溶解（如组织或细胞颗粒）
在这种情况下，在终端溶解体积中往往忽略样品的体积。样品溶液含有尿素（终浓度 9~9.5 mol/L；见注释 1 ) ，所选取的去垢剂（依照 2.3.1 中列表）终浓度为 2% ~4% ( m/V )，两性电解质 [ IPG：0.4% (w/v )； [CA] - IEF：2% (w/v) ] ，还原剂 ( 50 mmol/L DTT 或 5 mmol/L TBP 或 5 mmol/L TCEP)，将样品溶液加入固体样品中进行溶解，在水溶条件下进行超声波 30 min 会有助于蛋白质的溶解，通过高速离心 20000 g，30 min 去除不溶物质。
2. 蛋白样品从悬浮液或溶液中溶解
在这种情况下，必须考虑样品的体积。因此，有必要计算终体积。根据经验，样本量可以占最终提取体积的 35%。固体尿素、水和去垢剂贮存液，两性电解质要一同加入蛋白样品中来溶解蛋白质。
3.2 蛋白样品在尿素硫脲中的溶解
定量的蛋白样品体积通过水化过程进入 IPG 胶条中，如果是自制的 IPG 胶条，则可以制成比商业产品更宽一些，这时蛋白样品可调整至更大体积（最多 1 ml ) ，这样就可以稀释被浓缩的离液剂和蛋白样品。如果去垢剂能预先溶解在浓缩的离液剂中，其中还包含还原剂，那么样品体积占总溶解体积的 2%，如果去垢剂必须在最后加入，并且尿素的浓度不超过 8 mol/L，这样就很方便使用 1 份的样品，1 份的去垢剂贮存液和 8 份的浓缩离液剂。如果此方法使体积过大，可以用以下两种方法解决：
( 1 ) 在试管中加入相当于 1 份样品的去垢剂，在真空浓缩仪中进行浓缩后再加入 1 份样品和 4 份浓缩离液剂。
( 2 ) 考虑到样品体积占终体积的 40%，应称量相应量的尿素、硫脲和固体去垢剂，并且在冰浴条件下进行超声波溶解。所有情况下，蛋白样品先在室温下溶解 30~60 min，再在 200000 g，30 min 条件下离心去除不溶物质。
3.3 用于区带电泳的蛋白样品溶解
蛋白样品用 SDS 进行溶解不在本章中介绍，本章主要讲述蛋白样品在进行非对角电泳之前在尿素和阳离子去垢剂中的溶解情况 [ 16，17] 。计算样品溶解溶液中的组成很简单，蛋白样品占终溶解体积的 1/4，液体样品按如下顺序添加：0.4 体积的 20%(w/v) 阳离子去垢剂贮存液，0.2 体积还原剂，0.4 体积磷酸缓冲液和 2 体积的 8 mol/L 尿素。
混合后的样品溶液在水浴条件下超声处理 30 min，然后在 10000 g，15 min 条件下离心去除不溶物质。
1. 固体样品溶解（如组织或细胞颗粒）
在这种情况下，在终端溶解体积中往往忽略样品的体积。样品溶液含有尿素（终浓度 9~9.5 mol/L；见注释 1 ) ，所选取的去垢剂（依照 2.3.1 中列表）终浓度为 2% ~4% ( m/V )，两性电解质 [ IPG：0.4% (w/v )； [CA] - IEF：2% (w/v) ] ，还原剂 ( 50 mmol/L DTT 或 5 mmol/L TBP 或 5 mmol/L TCEP)，将样品溶液加入固体样品中进行溶解，在水溶条件下进行超声波 30 min 会有助于蛋白质的溶解，通过高速离心 20000 g，30 min 去除不溶物质。
2. 蛋白样品从悬浮液或溶液中溶解
在这种情况下，必须考虑样品的体积。因此，有必要计算终体积。根据经验，样本量可以占最终提取体积的 35%。固体尿素、水和去垢剂贮存液，两性电解质要一同加入蛋白样品中来溶解蛋白质。
3.2 蛋白样品在尿素硫脲中的溶解
定量的蛋白样品体积通过水化过程进入 IPG 胶条中，如果是自制的 IPG 胶条，则可以制成比商业产品更宽一些，这时蛋白样品可调整至更大体积（最多 1 ml ) ，这样就可以稀释被浓缩的离液剂和蛋白样品。如果去垢剂能预先溶解在浓缩的离液剂中，其中还包含还原剂，那么样品体积占总溶解体积的 2%，如果去垢剂必须在最后加入，并且尿素的浓度不超过 8 mol/L，这样就很方便使用 1 份的样品，1 份的去垢剂贮存液和 8 份的浓缩离液剂。如果此方法使体积过大，可以用以下两种方法解决：
( 1 ) 在试管中加入相当于 1 份样品的去垢剂，在真空浓缩仪中进行浓缩后再加入 1 份样品和 4 份浓缩离液剂。
( 2 ) 考虑到样品体积占终体积的 40%，应称量相应量的尿素、硫脲和固体去垢剂，并且在冰浴条件下进行超声波溶解。所有情况下，蛋白样品先在室温下溶解 30~60 min，再在 200000 g，30 min 条件下离心去除不溶物质。
3.3 用于区带电泳的蛋白样品溶解
蛋白样品用 SDS 进行溶解不在本章中介绍，本章主要讲述蛋白样品在进行非对角电泳之前在尿素和阳离子去垢剂中的溶解情况 [ 16，17] 。计算样品溶解溶液中的组成很简单，蛋白样品占终溶解体积的 1/4，液体样品按如下顺序添加：0.4 体积的 20%(w/v) 阳离子去垢剂贮存液，0.2 体积还原剂，0.4 体积磷酸缓冲液和 2 体积的 8 mol/L 尿素。
混合后的样品溶液在水浴条件下超声处理 30 min，然后在 10000 g，15 min 条件下离心去除不溶物质。
来源：丁香实验
