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WB电泳过程中上样孔样品残留怎么办?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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丁香实验

电泳过程中上样孔总是会有一些样品残留,虽然电泳的过程中也会都跑下来,但是严重影响结果。出现过很多次了,用的雅酶的制胶试剂盒,1.5mm,上样前对样品12000G离心3分钟,加的上清,每孔15ul。是什么原因怎么解决?

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23 个回答

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俗人无了

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相同的情况,作者是怎么解决的?

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dxy_h9snbtq9

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是不是电压太高了啊,跑浓缩胶的时候可以把电压调低一些,我们实验室常用的电压是120V左右,跑分离胶常用电压是200V左右
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一支肾上腺素

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不知道你这个是不是因为离心没离好,从内槽向外槽倒,我有次是分开倒的,就导致蛋白跑下不去,上样之前充分混匀。
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红格子一号

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感觉样品或者样品提取液有问题,溴酚蓝析出
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水深先试浅

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内槽电泳液得加满,让电荷形成循环
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dxy_h7vcp8v3

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可能是你上样时没有完全吸到上清,吸入了一部分沉淀。建议增加样品的体积,让上清足够多,样品上样前增大离心时间,确保沉淀被离下去。其次,上样的时候枪头不要一直伸到最底,建议在离沉淀远的位置轻轻取样进行上样。
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李瑞大

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1.loadingbuffer效果不好,无法把样品沉下去 2.样品甘油这种类似物比较多,导致样品上浮
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jey1235

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这是因为样品中有某种物质与loading buffer产生了化学反应,造成了溴酚蓝析出。其实普通的loading buffer buffer上样pH一般在6-9之间,切勿样品超过此范围。跟胶没有关系。样品可以稀释一下或者换一下样品的buffer。
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ZZDX-YILILI

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1.换下loading buffer试试看是否还会出现这种情况。 2.电泳缓冲液配置是否正确或者是否使用次数多了。 先从这两个方面排除下原因。
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dxy_bq4uxnd

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蛋白提取过程中应该是未能完全裂解,导致样品中存在杂质,杂质较为粘稠,跑胶时会出现这样的结果。
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此用户已注销

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我之前配胶都是自己配的溶液,没有试过试剂盒,出现这种情况也可能是样品的问题,组织样就很容易拖带,你可以把浓缩胶配的稍微多个3mm,用低电压跑多一点时间
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dxy_pggo2lp2

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这个问题的背景描述的不是清晰,我就依据现有的背景回答。1.考虑loading buffer,可能是loading没有充分与蛋白结合。2.考虑提取蛋白的时候的离心条件,我一般是提的上清蛋白,离心条件14000rpm,10min,4℃。不知道你这个是不是因为离心没离好。3.running buffer 从内槽向外槽倒,我师妹有次是分开倒的,就导致蛋白跑下不去。4.上样之前充分混匀。
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cathyxjjxjj

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样品量过多的话可以少上一点,比如上5微升,如果说是loadingbuffer里面染料过量的话可以让他跑出去或者后面固定的时候直接洗掉。
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dxy_4uyyu09r

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我经常遇到加不进去的情况,有时候是胶配置的问题,你这个下次可以低电压多跑一段时间,他们就压在一起了。
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Guoood

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上样前看看上样孔内是否有残胶在孔内或者其他杂质污染,上样前可以先用电泳液清洗下上样孔,可能会有改善。
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verbalkint

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换一下loading,这个loading可能沉不下去,或者蛋白里有lipid污染导致较轻。另外stacking gel跑慢一点,压久一点
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dxy_pni5ki46

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上样孔蛋白残留可能是没有彻底溶解,有可能变性不充分
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dxy_w4oj7yoe

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应该是样品里有太多脂质或沉淀导致的,可以增加煮样时间和煮样后离心时间,吸样的时候沿着液面吸,尽量不要吸到沉淀,如果还不行的话也可以考虑增加loading的量
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隔壁家的小夜猫子

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蛋白可能没沉,但是聚了,你可以加变性剂多点
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飞天幻雪

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你这个残留是随机的还是每次都这几个样品,如果是随机的怀疑你胶配的有问题,如果是每次都这样。你样品有问题,建议每次再重新煮沸后再加样
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