MTT 的操作方法（三）

一、MTT 法实验步骤

1. 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至 5~10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。

对于初学者而言，要使细胞达到 5~10×104/ml 往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
以一般细胞培养常用的 25 cm2 为例，

1) 细胞密度在长到约 80%~90%（下图所示为 80%~90% 密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入 3 ml 培养基使其混匀。



2) 另取一支新的 15 ml 无菌离心管（为下一步接种 96 孔板用），装入约 9 ml 培养基.

3) 从第一步准备的 3 ml 细胞悬液中取 1 ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于 5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板 4 个大格内每大格平均 5-10 个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按 50ul 计算。

4) 细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔 2000 个就可以（相当于细胞悬液密度为 2×104/ml），细胞毒性实验每孔 5000~10000 个（相当于细胞悬液密度为 5×104/ml）。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

2．将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入 100ul, 这样待测细胞的密度为 5000~10000/孔（边缘孔用无菌 PBS 填充）。
注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加 6 个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于 MTT 的结果至关重要。

3. 将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）, 加入浓度梯度的药物, 原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药. 一般 5-7 个梯度, 每孔 100ul, 设 3-5 个复孔. 建议设 6 个，否则难以反应真实情况。

下图可做为 96 孔板的的参考步局。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到 96 孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在 EP 管中将不同浓度的药物配好，然后将 96 孔板中的培养上清去掉（可以用排枪吸走）再加入 100ul 含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。

另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把 96 孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于 96 孔板干燥引起细胞死亡。

4. 5%CO2，37℃ 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。



5. 每孔加入 10ulMTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。

6. 终止培养，准备溶解结晶。

溶解结晶的方法有两种，第一种，用 DMSO 溶解

1)MTT 加入培养 4 h 后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把 Formazan 结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将 96 孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2) 每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液（见上面 MTT 甲瓒溶解液）

1)MTT 加入培养 4 h 后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入 100ul 溶解液。（该溶解液因含有 SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将 SDS 结晶全部溶解后再使用。）

2) 放入培养箱中继续孵育 4~6 小时，镜下观察，待结晶全部溶解后 570nm 测吸光度。通常 37°C 孵育 4 小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待 4~6 小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测 OD 值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对 OD 值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测 OD 值就可以了。

7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。