Northern 印迹分析实验（基本方法三）

印迹杂交是指将待测核酸片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中的标记探针进行杂交的过程。Northern印迹技术（Northern blot）是分析RNA的一种方法，因与Southern印迹技术对应而被趣称为此。

该技术可定量分析某一特异基因转录的强度，根据其迁移的位置也可判断基因转录产物的大小。该技术常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。

Northern印迹技术的基本原理是首先将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到尼龙膜等固相载体上，通过用放射性同位素标记特异的DNA或RNA探针，与具有特异碱基序列的单链RNA进行杂交，去除非特异性杂交信号后经放射自显影，对杂交信号进行分析，可鉴定特异RNA分子的含量及大小。

Northern印迹技术可用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究等。

器材：

①电泳仪、电泳槽、制胶模、梳板、玻璃板、托盘

②紫外分光光度计、紫外检测仪

③离心机、恒温水浴箱、真空烤箱

④硝酸纤维素滤膜、Whatman 3 MM滤纸、吸印纸、保鲜膜、杂交袋

⑤微量移液器（20 μl）、枪头（灭菌）、1.5 ml Eppendorf 管（灭菌）

⑥放射自显影盒、X线胶片

试剂：

①材料：RNA、已标记好的探针

②37％ 甲醛、5x甲醛电泳缓冲液、甲醛凝胶加样缓冲液

③EB溶液

④RNA分子质量标准（Marker）

⑤20xSSC、6xSSC、2xSSC和0.1xSSC、50xDenhardt＇s溶液

⑥0.1％ DEPC（焦碳酸二乙酯）、灭菌水

⑦预杂交溶液

⑧0.1％ SDS

Northern印迹的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）0.1％ DEPC（焦碳酸二乙酯）。

（2）5x甲醛电泳缓冲液 700ml经DEPC处理的灭菌水溶解20.9 g MOPS［3-（N-吗啉代）丙磺酸］，用2 mol／L NaOH调节溶液的pH值至7.0。

加10 ml经DEPC处理的1 mol／LCH3COONa溶液和10 ml经DEPC处理的0.5 mol／L EDTA（pH8.0），用0.1％ DEPC处理 的灭菌水定容至1 L，过滤除菌，室温避光保存。

终浓度为0.1mol／L MOPS（pH 7.0），10 mmol/L CH3COONa,5 mmol/L EDTA(pH 8.0)。

（3）EB溶液 0.5 μg／ml EB，0.1 mol／L乙酸铵。

（4）甲醛凝胶加样缓冲液 0.25％ 溴酚蓝，0.25％ 二甲苯青，50％ 甘油，1 mmol／LEDTA（pH 8.0），用0.1％ DEPC 37 ℃处理过夜，高压灭菌，常温保存。

（5）37％ 甲醛 12.3 mol／L，pH大于4.0。

（6）20xSSC 800 ml H₂O溶解175.3 g NaCl、88.2 g柠檬酸钠，14 mol／L HCI调节 pH至7.0，用H₂O定容至1 L，终浓度为3 mol／L NaC1、0.3 mol／L柠檬酸钠。

（7）6xSSC、2xSSC和0.1xSSC 用20xSSC稀释。

（8）50xDenhardt＇s溶液 1％ Ficoll-400,1％ PVP（聚乙烯吡咯烷酮），1％ BSA（牛血清白蛋白），过滤除菌后于-20 ℃贮存。

（9）预杂交溶液 6xSSC，5xDenhardt＇s溶液，0.5％ SDS，100 mg／ml鲑鱼精子DNA，50％ 甲酰胺。

（10）杂交溶液 预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。

（11）20％ SDS 900 ml H₂O溶解200 g SDS（加热到68 ℃并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解），浓HC1调节pH至7.2，用H₂O定容至1 L，室温保存。使用时按比例稀释。

（二）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

（1）电泳槽用去污剂洗干净，蒸馏水冲洗，无水乙醇漂洗干燥，3％ H₂O₂处理10 min，最后用DEPC处理过的三蒸水彻底冲洗，以去除电泳槽内的RNA酶。

（2）将1.5 g琼脂糖加热溶于62 ml DEPC处理的灭菌水中，冷却至60 ℃，加入20 ml 5x甲醛电泳缓冲液和18 ml甲醛至终浓度分别为1x及2.2 mol／L。

在化学通风橱内，将融化的凝胶倒入制胶模中，梳板置于一端，底部与制胶模之间留下0.5～1 mm间隔，凝胶厚度在3～5 mm。

（3）待凝胶凝固后，将制胶模放入电泳槽内，并向其中加入1x甲醛电泳缓冲液，液面高出凝胶表面1～2 mm，小心拔出梳板。

（4）在1.5 ml Eppendorf管内，混合下列试剂：制备样品RNA 2 μl（20μg），5x甲醛电泳缓冲液4 μl，37％ 甲醛3.5 μl，甲酰胺10 μl，总体积为20 μl。

（5）将上述样品混匀，65 ℃孵育15 min，迅速冰浴冷却，离心5 s，使管内所有液体集中在管底。加2 μl甲醛凝胶加样缓冲液混合待用。

（6）加样前，将制备好的凝胶先预电泳5 min。随后将样品加至凝胶的加样孔中，并在凝胶最外侧加样孔中加入RNA分子质量标准。

（7）接通电源线，样品孔处于电泳槽的阴极端，开启电源开关。调整电压为3～4V／cm。每1～2 h将正负极电泳槽内液体混合1次。

（8）电泳结束后，切下RNA分子质量标准所在的凝胶条带，浸入EB溶液中染色30～45 min。在紫外灯下，观察RNA电泳条带的迁移距离，照相记录。

（三）转移

（1）切除无用的凝胶部分，在加样孔一侧切去一角，作凝胶方位标记。

（2）将凝胶用经DEPC处理的水漂洗数次，以去除所含的甲醛。

（3）裁1张硝酸纤维素膜，2～4张3 MM滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。

将硝酸纤维素膜剪下一角做相应的方位记号。然后先用无菌水完全湿透，再用20xSSC浸泡。接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴橡胶手套操作。

（4）在转移盘中放一块比胶大的平板，上面铺一张3 MM滤纸，滤纸两边浸泡在20xSSC缓冲液中。去除滤纸与平板之间的气泡。

（5）将凝胶放置在滤纸上，使其电泳时向上的一面朝下，去除两层之间出现的气泡。然后将浸湿的硝酸纤维素膜一次准确铺在胶上，对齐。

铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。再用2张浸过2xSSC缓冲液的3 MM滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，同样要把气泡赶去。

（6）把一叠干的吸印纸放置在3 MM滤纸上，在吸印纸上再放一块玻璃板，加压约500 g重物。

（7）转移 上述步骤完毕，开始进行RNA转移。通过滤纸的吸附作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将RNA吸印到膜上。需持续6～18 h，期间如果吸印纸过于潮湿，应换新的干燥的吸印纸。

（8）固定转移后，取出硝酸纤维素膜，浸泡在6xSSC溶液中5 min，以去除琼脂糖凝胶碎块。

空气干燥膜片，然后在真空烤箱内80 ℃烘烤2 h。烘过的膜可在室温下干燥保存，待杂交。

（四）预杂交

(1)将转移RNA的硝酸纤维素膜放入塑料袋内，加入预杂交液（约200 μl／c㎡），前后挤压塑料袋，使硝酸纤维素膜湿透。

(2)排除袋中的气泡，然后将塑料袋密封，于42 ℃水浴中孵育2～4 h，弃去预杂交液。

（五）杂交

向塑料袋中加入杂交液（预杂交液加入标记好的探针即为杂交液），重新将其密封。然后置于42℃水浴中杂交16～24 h。

（六）漂洗

（1）弃去杂交液，取出硝酸纤维素膜，在室温下，用2xSSC／0.1％ SDS溶液漂洗2次，每次15 min。

（2）室温下，用0.1xSSC／0.1 ％ SDS溶液漂洗2次，每次15 min。

（3）55 ℃，用0.1xSSC／0.1％ SDS溶液漂洗2次，每次30 min。

（七）放射自显影

漂洗后的硝酸纤维素膜，经空气干燥，用保鲜膜包好。然后在暗室中，于胶片盒内在膜两侧各压上1张X光片，-70 ℃放射自显影。时间视杂交强度而定，24 h～10 d不等。通常曝光1～2d后可见RNA谱带。

（八）实验结果及分析

（1）电泳结束后，应在紫外线下仔细观察RNA电泳分离效果是否良好、RNA样品有无降解、RNA带型是否清晰、有无拖尾及边缘是否模糊等现象。

（2）放射自显影后，观察X光片上曝光显示的条带，对照RNA分子质量标准条带的迁移距离，即可查出凝胶电泳中相应的RNA的位置，从而知道基因转录的RNA的大小。

利用“自动光密度扫描仪”扫描曝光的条带，计算条带的积分光密度值，以内参照RNA条带的积分光密度值为校正值，即可确定不同样品基因转录的表达强度。

（1）RNA易被 RNA酶降解，因此需要消除外源性RNA酶的污染，尽量抑制内源性RNA酶的活力。

实验所用到的试剂的配制均需用DEPC处理（DEPC终浓度为1％），玻璃器皿使用前需200 ℃干烤4 h，塑料器材用含有0.1％ DEPC的水于37℃浸泡过夜，然后高压灭菌，确保RNA酶的降解，并去除器皿上痕量的DEPC。

实验人员必须戴一次性手套及口罩，实验方案环境应清洁干净，创造一个无RNA酶的环境。

（2）在凝胶中不能加EB，因它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加分子质量标准一同电泳，之后将分子质量标准所在的条带切下，染色、照相。

样品胶则进行Northern转印。EB是一种诱变剂，皮肤长期接触易发生皮肤癌。因此在操作EB时应戴上聚乙烯手套防护。

（3）如果琼脂糖浓度高于1％，或凝胶厚度大于0.5 cm，或待分析的RNA大于2.5 kb，需用0.05 mol／L NaOH 浸泡凝胶20 min，部分水解RNA并提高转移效率。

浸泡后用经DEPC处理的水淋洗凝胶，并用20xSSC浸泡凝胶45 min。然后再转移到硝酸纤维素膜上。

（4）操作凝胶及硝酸纤维素膜时，要戴上棉布手套，以防止脏物和油脂污染，导致转移失败。

（5）不能使硝酸纤维素膜上的滤纸接触到凝胶下的滤纸，否则形成短路流动使转移均。可用保鲜膜将凝胶缘封围。

（6）将硝酸纤维素膜铺在凝胶上时，膜一经与凝胶接触即不可再移动。因为从接触的一刻起，转移就已经开始。

（7）杂交时，不要留过多面积，浪费预杂交液及杂交液，同时塑料袋内不要留有气泡，否则预杂交及杂交都不均匀。

（8）孵育前，检查塑料袋是否密闭，勿使袋内液体流出，以及水浴箱内液体流入。

（9）漂洗强度可根据所杂交的分子大小、同源区段的大小来确定，可适当调节漂洗液强度（改变离子强度）、漂洗温度和漂洗时间，同时亦可用放射性测定仪检测漂洗情况。

（10）在杂交及放射自显影过程中，应戴上手套防护。杂交了同位素的膜片用保鲜膜包裹好，不要污染其他器皿。