组织印迹的Northern杂交
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组织印迹的 Northern 杂交
1 ）硝酸纤维素膜或尼龙膜上的组织印迹
1． 在塑料板上放置两层 Whatman 1 号滤纸，在滤纸上方放上一张普通纸，然后铺上一层尼龙膜。
2． 用双面刀片从植物组织如大豆的茎上切取一块切片（厚度约为 1mm ）。如果组织表面是湿的，则在 Kimwipes 纸上轻轻吸干或先用蒸馏水洗涤几秒钟然后再用 Kimwipes 纸吸干。用镊子将组织切片转移到硝酸纤维素膜上，注意一旦将切片放置在膜上就不得再移动切片。在切片上放置 4 层 Kimwipes 纸，用手指轻压 15 ～ 20 秒，用镊子小心拿开纸和组织切片。组织切片经甲苯酸蓝染色后观察其解剖结果。
3． 80 ℃真空烘烤留有组织印迹的尼龙膜 2 小时或用 UV cross-linker 在紫外光下照射尼龙膜。
4． 将留有印迹的膜面向下，放入载玻片上的一滴甲苯酸蓝溶液中，对组织切片进行染色。 2 ～ 3 分钟后，吸干多余的染料，用间接照明立刻照相。将载玻片翻转，透过玻璃拍摄被染色的组织切片。在切片上粘上几张纸片以免组织切片接触显微镜。
2 ）用 35 S －标记的 RNA 探针检测植物印迹中的 mRNA
1． 在 Seal-A-MealTM 塑料带中倒入 30 ～ 40ml 洗涤溶液 I ， 65 ℃清洗留有印迹的尼龙膜 4 小时。
2． 将膜放入 20ml 杂交溶液中， 68 ℃预杂交 4 小时。
3． 将膜和用 35 S- 标记的 RNA 放入 10ml 杂交溶液中， 68 ℃杂交 20 小时。
4． 在 100ml 洗涤溶液Ⅱ中 42 ℃清洗尼龙膜 20 分钟，换上新鲜洗涤溶液，重复清洗 2 次。
5． 用 100ml 洗涤溶液Ⅲ在适当的温度下（ 60 ～ 68 ℃）。用手提式微型检测器监控尼龙膜上剩余的放射性。清洗完毕后，有义 RNA 探针杂交的膜不再有放射性信号，但用反义 RNA 探针杂交的尼龙膜一般具有可检测的放射性信号。该信号的强度依赖于目的 RNA 的丰度。室温下用 0.2 × SSC 对尼龙膜进行简单清洗，在空气中晾干。
洗涤缓冲液Ⅲ：
0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
6． 将膜暴露在 X- 射线胶卷或 Kodak T-max 400 胶卷下进行放射自显影。用水平力如一小叠书使膜和胶卷保持良好的接触。一般来说，利用 T-max 400 胶卷比 X- 射线胶卷具有更高的分辨率。放射自显影的时间依赖于放射性信号的强弱，通常从 4 小时到 4 天。
7． 在 X- 射线处理器中对 X- 射线胶卷显影。把 T-max400 胶卷浸入 Kodak T-max 显影液 I 中显影 1 分钟，将底片转移到显影终止盘中 30 秒后浸入 Kodak 快速定影液中 5 分钟，然后用蒸馏水洗涤 5 分钟。
8． 在解剖显微镜下观察组织印迹中 mRNA 的位置。用 Kodak Technical Pan Film 2415 胶卷拍摄 mRNA 的定位模式，然后和用苯甲酸蓝染色的组织切片解剖结果比较。
