RNA印迹(Northern Blot)

【实验目的】

掌握RNA印迹技术的基本原理，学习RNA印迹技术的操作方法，了解RNA印迹技术的意义与应用。

【实验原理】

将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，用于与DNA探针杂交以鉴定其中特定RNA分子的大小与含量。基本原理与Southern印迹相同，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，因为碱会导致RNA的水解。

Northern印迹主要用于组织细胞靶基因表达水平的研究以及对同一组织细胞的不同基因间的表达水平进行比较，或者对不同组织细胞间相同基因的表达水平进行比较。

【实验对象】

待测RNA样品。

【试剂与器材】

1． 焦碳酸二乙酯 (DEPC)。

2． 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳所需试剂。

3． 0.5 mol ／ L乙酸铵(NH4Ac)。

4． 溴化乙啶 (EB)：0.5μg／ml，溶于0.5mol／L 乙酸铵中。

5． 0.05mol ／ L NaOH／1.5mol／L NaCI (选用)。

6． 0.5mol ／ L Tris·CI (pH 7.4) ／1.5mol／L NaCl (选用)。

7． 20×SSC、6×SSC和2×SSC。

8． 亚甲蓝（终浓度为0.03％），溶于0.3mol ／ L (pH 5.2) 的乙酸钠缓冲液中 (选用)。

9． 硝酸纤维素 (NC) 膜或尼龙膜。

【实验方法与步骤】

1. RNA甲醛变性凝胶电泳（5V/cm, 3h）, （见附录三）。

电泳结束后用EB染色：取出凝胶，切下需要染色的泳道，放置于无RNA酶的玻璃平皿，加入0.5mol ／ L乙酸铵浸泡20min。换液再浸泡20min以除去甲醛，将凝胶转入含0.5(g ／ ml EB的0.5mol ／ L乙酸铵溶液中染色40min，必要时，以0.5mol ／ L乙酸铵脱色1h。

3． 在紫外透射仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。

4． 将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿中，加足够的DEPC处理的去离子水浸洗几次以除去甲醛。

5. 凝胶浸泡在10倍体积的0.05mol/L NaOH ／ 1.5mol/L NaCl中30min，使RNA部分水解。接着浸泡于10倍体积的0.5mol/L Tris·C1(pH 7.4) ／ 1.5mol/L NaCl缓冲液中和30min (可选), 将胶的多余部分切除，并切边标记。

6． 将溶液换成10倍体积的20×SSC，浸泡45min。

7． 在一玻璃或塑料平皿中放置-块比凝胶略大的有机玻璃作为平台 (必要时，可并排放两块或更多) ，加入足够的20×SSC以使平台半淹没在液体中。

8． 构筑转移平台，剪3张与平台同样大小的Whatman 3MM滤纸，放在平台表面，以20× SSC润湿。把凝胶置于滤纸表面，用玻棒滚动表面以压挤去除气泡。切4条塑料保鲜膜覆盖在凝胶的边缘。

9． 剪一片与凝胶暴露面积大小相当的尼龙膜或NC膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5mm深的用DEPC处理的去离子水，将膜漂在水面使之润湿，直至膜沉没在水中。如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5min，如果是NC膜，则换成20×SSC再浸泡10min。

10．将润湿的膜放在凝胶表面，用干净刀片切去滤膜一角， 使其与凝胶的切角相对应，排去气泡，以20×SSC漂洗膜表面。切 3张与膜大小相当的湿润的Whatman 3MM滤纸，放于膜的表面。赶出气泡。然后将与膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4cm。

11． 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物 (0.2～0.4kg) ，放置过夜。

12． 拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶。在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。

13．用2×SSC洗膜，然后放于滤纸上，让膜于室温干燥30分钟。NC膜则应夹于2张Whatman 3MM滤纸之间， 80℃真空干烤2h。将干的转印膜置于可透过紫外线的塑料保鲜膜中，带有RNA的一面朝下，置于紫外透射仪（波长在254nm）上，以合适的照射强度进行紫外线交联,以固定RNA。备作核酸杂交。

14． 凝胶可按步骤2，用EB染色以检查转印效率。

【注意事项】

1． 为了抑制RNA酶的活性，所有用于Northern印迹的溶液，均须用经DEPC处理过的无菌去离子水配制。DEPC是一种致癌剂，须小心操作。尤其在用DEPC处理乙酸铵时，因为DEPC能与铵离子反应产生氨基甲酸乙酯（一种潜在的致癌剂），故在以DEPC处理乙酸铵时，更须分外小心。

2． RNA极易被环境中存在的RNA酶降解，因此须特别警惕RNA酶的污染。

　思 考 题

1. 核酸杂交技术的基本原理是什么？

2．影响RNA印迹效果的主要因素有哪些？

3. Northern Blot技术的应用范围有哪些？