Northern blot技术
最新修订时间：
原理
将RNA样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移至尼龙膜等固相膜载体上，用放射性或非放射性标记DNA或RNA特异性探针对固定于固相膜上的mRNA进行杂交，洗膜去除非特异性结合杂交信号，经放射自显影或现色反应，对杂交信号进行分析。将杂交的mRNA分子在电泳中迁移位置与标准分子量分子进行比较，即可知道细胞中特定的基因转录产物的大小；对杂交信号的强弱比较，可以知晓该基因表达mRNA水平的强弱。
材料与仪器
DNA
MOPS电泳buffer 甲醛凝胶加样buffer EB EGFR探针 DIG SSC
水平电泳仪 制冰机 恒温水浴箱 凝胶成像系统 EP管 移液器 Tip头
MOPS电泳buffer 甲醛凝胶加样buffer EB EGFR探针 DIG SSC
水平电泳仪 制冰机 恒温水浴箱 凝胶成像系统 EP管 移液器 Tip头
步骤
一、RNA转移与固定
1. 变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1xMOPS buffer淋洗凝胶片刻，10xSSC中浸泡平衡凝胶30 min。
2. 按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。
3. 1xSSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。
4. RNA染色，干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。
5. 于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。
6. 去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。
5. 于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。
6. 去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。
二、预杂交、杂交及显色
1. Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。
2. 100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。
3. 100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。
4. Washing buffer洗膜（15 minx2）。
5. 20 ml detection buffer 平衡2~5 min。
6. 将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动）。
7. 当出现条带时，TE-buffer洗膜（5 minx1），终止现色。
7. 当出现条带时，TE-buffer洗膜（5 minx1），终止现色。
8. 照相记录，80℃烤干，储存。
9. 扫描计算EGFR基因扩增的倍数。
注意事项
1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。
2. 凝胶中最好不要加入EB，以免降低杂交的效率。
3. 为降低膜杂交本底，可适当延长预杂交时间。
来源：丁香实验
