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大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养

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材料和方法

1、仪器:

手术器械一套,倒置显微镜(Leica),CO2细胞孵育箱(Heraeus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),扫描电子显微镜(Hitachi)。

2、主要试剂:

DMEM高糖培养基(Gibco),胎牛血清(Hyclone,杭州四季青生物工程材料公司),胰蛋白酶、EDTA(Ameresco);小鼠抗人CD105单克隆抗体(NeoMarkers),兔抗人CD34、CD31多克隆抗体(Antibody Diagnostica Inc),兔抗人vW因子多克隆抗体(华美公司),抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品,其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3、方法:

植块法原代细胞培养:

细胞培养瓶的处理:选用50ml玻璃培养瓶,高压蒸汽灭菌,瓶底铺自制鼠尾胶(制作方法参见2),移入80℃烤箱烤干,临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠(雌雄不限,购自复旦大学实验动物部),1%戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉,75%酒精浸泡5min消毒,将大鼠移至超净台进行操作,止血钳固定四肢,逐层打开胸腔,暴露心脏,剪开心包,由升主动脉处剪下心脏,放入D-Hanks平衡盐缓冲液中.

冲净心腔中的血液,辨清心脏解剖结构,去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔,保留左心室,小心去除心内膜及心外膜,用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方,滴加1ml进口胎牛血清.

均匀接种于处理过的50ml培养瓶中,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养,使其贴壁,4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶,约48小时后组织块周围有星形细胞长出.

80至96小时组织块周围有大量细胞长出,去除组织块,继续培养36-48小时,待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代,取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

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