人脑微血管内皮细胞构建血脑屏障

血脑屏障 （Blood-Brain Barrier, BBB） 是由微血管内皮细胞、基底膜和周围星形胶质细胞组成的一种高度特化的生物屏障，能够保护中枢神经系统 （Central Nervous System, CNS） 免受外界有害物质的侵害。

人脑微血管内皮细胞是构建血脑屏障的重要细胞类型，其主要作用是通过细胞间紧密连接和特殊的转运通道，限制了大多数药物、病原体和其他有害物质的通过，同时保留了对神经营养物质和代谢产物的选择性通透性。

通过体外培养的方式，将人脑微血管内皮细胞与周围星形胶质细胞等神经组织细胞共同生长，形成与真实血脑屏障相似的生物屏障。

研究药物渗透性、神经营养物质的转运机制、神经炎症和神经退行性疾病等领域。

hBMEC、DMEM 培养液、细胞培养箱

EDTA-胰酶、HAC 溶液、冰醋酸、ddH₂0

胶原储存液、工作液及孔径为 0.4 μm 的 Transwell 小室

各种孔板和培养皿、T25 细胞培养瓶

4% 多聚甲醛、HE 染色液、鬼笔环肽染色液

显微镜、载玻片、盖玻片

1. hBMEC 使用含 10% FBS 和 1% 双抗的 DMEM 培养液，置于 37 ℃、5% CO₂ 细胞培养箱中培养，培养液每 2 天更换一次。hBMEC 长至 100% 满 2 天后传代，使用 0.25% EDTA-胰酶消化并吹散成单个漂浮细胞，接种新瓶后约 1 h 即开始贴壁。

2. Collagen type I 包被 Transwell 小室

（1）配制 0.006 mol/L （0.36 g/L）的 HAC 溶液 100 mL：取 34.5 ul 冰醋酸加入 100 ml ddH₂0，混匀后用 0.22 μm 滤器除菌后待用。

（2）配制 0.1 mg/mL 胶原储存液：取 1 mL 5 mg/mL 胶原加入 49 mL 配制好并已滤过除菌的 0.006 mol/L HAC 溶液至 50 mL 离心管，轻轻颠倒，分装到 15 mL 离心管 4 °C 保存。

（3）制备工作液及 Transwell 包被：Transwell 小室按照 10 μg/cm² 包被。将储存液稀释成 0.06 mg/mL 工作液即 1000 μL  0.1 mg/mL 储存液加入 800 μL 0.006mol/L HAC。

（4）Transwell 小室每孔加入 187 μL 胶原工作液确保胶原蛋白溶液铺满器皿的表面，超净台室温过夜干燥。接种细胞前用 DMEM 培养液漂洗。包被胶原后的 Transwell 放入 12 孔板中，4 °C 可至少保存 3 个月，随用随取。

3. 单层 hBMEC 屏障模型的建立

将 T25 细胞瓶中生长至 100% 汇合的 hBMEC 用 0.25% EDTA-胰酶消化后用含 10% FBS 和 1% 双抗的 DMEM 培养液重悬，并以 5x10⁵/mL 的密度接种于 Collagen type I 包被的 Transwell 上室，接种量为 500 μL，下室加入 1.5 mL DMEM 完全培养液保证 Transwell 小室内外液面平齐，每 2 天换完全培养基一次。

4. 单层 hBMEC 屏障模型生长情况观察

（1）单层 hBMEC HE 染色：通过 HE 染色观察细胞是否成功接种并生长在多聚膜上以及生长数量、密度等。hBMEC 接种 Transwell 小室 4~6 天后取一孔 4% 多聚甲醛室温固定 15 min，ddH₂0 漂洗 3 次后 HE 染色，剪下多聚膜固定在载玻片上，普通光学显微镜观察细胞在膜上生长情况。

（2）单层 hBMEC 鬼笔环肽染色：由于 HE 染色仅能观察到细胞在多聚膜上是否生长以及大致的密度，并不能很好的反映出 hBMEC间微观结构，所以使用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色以观察细胞与细胞间生长的紧密程度及细胞在多聚膜上的微观状态。即 4% 多聚甲醛室温固定 15 min，PBS 漂洗 3 遍后加入鬼笔环肽染色液，每孔 100~200 μL，37 ℃ 孵育 30 min 后剪下多聚膜并固定于载玻片上共聚焦显微镜观察

5. 屏障功能测定

接种后第四天开始，每隔两天于换液时上下室各加入培养液 500 ul 可形成明显液面差（约 0.5 m），以不接种细胞的 Transwell 小室为空白对照若无法形成液面差，液面差出现说明细胞已生长至汇集且足够紧密。

每次换液前使用细胞电阻仪测量 Transwell 小室两侧的跨膜电阻，并绘制 TEER 随时间变化曲线，当该曲线明显上升并进入平台期，说明屏障形成。

1） 选择来源可靠的人脑微血管内皮细胞，以保证模型的可靠性和稳定性；

2） 建立合适的细胞培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和气体含量等；

3） 严格控制培养过程中的细胞密度和培养时间，以保证模型的一致性和稳定性；

4） 在模型搭建完成后，应该对其进行验证和评估，以确保其模拟真实血脑屏障的能力。

参考文献：

庞博.人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养体外血脑屏障细胞模型的建立[D].南京农业大学,2018.DOI:10.27244/d.cnki.gnjnu.2018.000460.

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