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大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养

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【摘 要】目的:培养脑皮质微血管内皮细胞。方法:取1~5d Wistar乳鼠脑皮质,经不同孔径的筛网过滤后,用胶原酶振荡消化获得的微血管内皮细胞进行培养,用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果:培养的细胞呈单层贴壁生长,7~9d呈典型的铺路卵石样征象。结论:建立了一种简便易行的培养脑皮质微血管内皮细胞的方法。

【关键词】 细胞培养;微血管内皮细胞;Wistar大鼠

脑微血管内皮细胞是构成血脑屏障的主要成分,具有特殊的形态结构和机能,在许多病理状态下起重要作用[1]。建立脑微血管内皮细胞体外培养,可获得大量比较单纯的内皮细胞,为研究血脑屏障和脑血管疾病以及新药筛选提供实验模型。本文报告大鼠脑皮质微血管内皮细胞培养的一种方法。

1.材料与方法

1.1 鼠脑皮质微血管内皮细胞培养

1.1.1 鼠脑皮质微血管内皮细胞的分离  取10~12只1~5d的Wistar大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供),雌雄兼用,于超净工作台上操作者左手拇食二指持乳鼠颈部稍下处,常规消毒头皮后,右手持眼科剪沿正中线剪开头皮与颅骨,用眼科弯镊取出鼠脑。取出的脑立即放入盛有冰冷Hank's液的平皿中。去除大血管、软脑膜、脑干、小脑和大脑髓质。将收集到的大脑皮质,转入另一先放有170μm不锈钢筛网的冰冷Hank's液的平皿中,用玻璃吸管反复吹打呈脑匀浆,弃滤液,再用Hank's液反复冲洗网上的血管,将收集的血管段液再经孔径75μm尼龙网过滤,500转离心3min,弃上清,收集沉淀的血管段。

1.1.2 原代微血管内皮细胞培养 将 微血管段移入0.1‰的Ⅶ胶原酶中37℃振荡消化20min,800r/min离心3min,弃上清,沉淀物加入含15%胎牛血清的M199(完全培养液)制成细胞悬液,接种于35ml 塑料培养瓶(Nunclon)中(瓶底朝上),置37℃,5%CO2培养箱孵育,2h后翻转培养瓶(瓶底朝下),1d后换全液,以剔除混杂的非内皮细胞,以后每3d换完全培养液1次进行细胞原代培养。

1.1.3 细胞传代培养 细胞原代培养7~9d后,细胞呈单层密集生长近亚融合时进行传代繁殖,以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化细胞,见细胞大部分脱落时加入完全培养液终止消化,轻轻吹打,制成细胞悬液,按实验需要传代,传代时接种密度为3×104 /ml。

1.2 特性鉴定

1.2.1  形态学 用Olympus倒置显微镜观察内皮细胞的形态及生长规律。

1.2.2 用MTT法测内皮细胞的生长率  传代培养至第3代,接种于24孔培养板中,接种密度为3×104/ml,在1~11d 内,每天收集3孔的细胞进行MTT法测细胞的活力。即细胞培养至所选时间,弃上清,每孔加入400μl M199,40μl MTT继续培养4h后,离心2000转,5min,弃上清,每孔加入400μl二甲基亚砜溶解紫色结晶,再转入96孔板,于自动酶标仪上测定OD570 值,吸光度值的大小反映内皮细胞成活数量及活性。

1.2.3  免疫组化 将长有细胞的盖玻片取出,用浓度为0.1 mmol/L PBS漂洗后,4℃丙酮固定10min,滴加Ⅷ因子相关抗原的抗体(博士德,即用型),再按通用型SP kit (北京中山)说明进行操作,DAB显色,封片后镜下观察和照相。

2.结 果

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜观察分离的微血管段形态各异,长短不等,呈单枝或多枝状。经胶原酶消化后,微血管管壁不清,壁上内皮细胞清晰可见。2h后翻转培养瓶,目的是去除首先贴壁的长梭形成纤维细胞。混悬液内还有未分离干净的神经组织碎片和红细胞,1d后换全液即可清除,换液后可见大部分微血管片段已贴壁,边缘长出单个内皮细胞,呈三角形或长梭形,排列不规则,核淡,胞膜明显,2~3d可见细胞分裂增殖形成散在细胞群落,7~9d融合成片状,细胞紧密排列,互不重叠,呈典型的铺路卵石样结构(见图1)。传代细胞初种时为明亮的园球形,悬浮于培养液中,4h后大部分细胞贴壁,呈扁平状,24h后细胞胞体变大,随培养时间延长,细胞多呈三角形或长梭形,7d后细胞增殖成单层片状。传至第4代时细胞轮廓欠清。测定第三代内皮细胞的生长率表明内皮细胞的生长高峰在7~9d 以后不再增殖,出现生长接触抑制现象。

2.2 免疫组化

原代、第三代内皮细胞进行ⅧF:Ag免疫组化检查,95%以上细胞的胞浆和核膜周围被染成棕褐色,证实培养的内皮细胞为血管内皮细胞。

3.讨 论

血管内皮遍布全身,位于整个循环系统的内表面,它不仅是血管的被动衬里,而且是肌体最大的内分泌腺[2]。由于它所处的特殊位置,可通过不同的机制和生化信息,来释放血管活性物质、细胞因子和生长因子,以调节免疫反应、血液流动性、凝血过程、血管床张力及通透性,参与正常和新生组织的血管形成。脑微血管内皮细胞是位于毛细血管微循环的一种特殊细胞,具有极其重要的功能。它是构成血脑屏障的主要成分,同时与脑水肿、脑血管疾病的发生发展、脑肿瘤的浸润和扩散,尤其是脑肿瘤的血管形成等病理过程紧密相关。我们对鼠脑皮质微血管内皮细胞培养的偿试,为体外研究各种颅脑疾病提供一种崭新的实验工具。由于不同来源的血管内皮细胞之间存在较大的差异性,人们常根据不同的研究目的选取不同的血管内皮细胞进行培养。

国外对脑微血管内皮细胞的分离培养始于70年代末,难点主要在于脑微血管分离步骤繁杂、内皮细胞难以纯化,建立与维持微血管内皮细胞很难,且有些方法不适合于国内普通实验室,如需要高速冷冻离心机和价格昂贵的内皮细胞生长因子等 [3],故国内关于脑微血管内皮细胞培养方法的报道较少。我们根据本校条件,探讨了培养大鼠脑微血管内皮细胞的方法,成功进行了Wistar 乳鼠大脑皮质微血管内皮细胞的体外培养。

根据我们的体会,培养时应注意以下几点:

(1)仔细剥离软脑膜,去除脑干、大血管、小脑和大脑髓质后,吹打成匀浆的脑组织经过 170μm和75μm两种孔径滤网过滤,这样既可去除较大组织块和大血管,又可达到收集微血管段的目的,因据Brendel等[4]研究发现鼠脑微血管的直径在6~80μm之间,分离脑微血管多选直径80μm左右的滤网筛选。

(2)胶原酶充分消化。我们用0.1‰的Ⅶ胶原酶在37℃恒温摇床振荡消化20min即可。酶充分消化有助于内皮细胞的迁移、去除周皮细胞。消化时间的长短因胶原酶的类型与不同的浓度而有所不同。

(3)原代培养时需收集到足够量的微血管,否则培养难以成功。

(4) 原代培养2h后,翻转培养瓶以去除先贴壁的成纤维细胞,24h后换液一次以去除未贴壁的杂质,净化培养环境。开始培养的2~5d,在倒置显微镜下用机械方法(细胞刮刀)刮去可疑的细胞或细胞群落。(5)传代培养时,只收集最先脱落的细胞进行培养,这是因为内皮细胞具有贴壁早,而在酶消化时易脱落的特性[5]。(6)培养内皮细胞最好选用含15%胎牛血清的M199培养液来培养,这样有利于内皮细胞的生长、逐渐淘汰混杂的神经元和胶质细胞。

参 考 文 献 

[1] Chi OZ, Wei NM, Sinha AK, et al. Effects of inhibition of nitric oxide synthase on blood-brain barrier transport in focal cerebral ischemia[J]. Pharmacology,1994;48:367-373.

[2] Inagami T, Naruse M, Richard H. Endothelium as an endocrine organ[J]. Annu Rev Physiol,1995;57:171-189.

[3] Gordon EL, Danielsson PE, Hguyen TS, et al. A comparision of primary cultures of rat cerebral microvascular endothelial cells to rat aortic endothelial cells[J]. In Vitro Cell Dev Biol,1991;27A:312-326.

[4] Brendel K, Meezan E, Carlson EC. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex[J]. Science, 1974;185:953-955.

[5] Browman PD, Betz AL, Diane AR,et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain[J]. In Vitro,1981;17(4):253-262.

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