材料与仪器
Kamovsky固定液 多聚甲醛 戊二醛 二甲砷酸钠
步骤
一、固定
1.用 Kamovsky 固定液灌注。Kamovsky 固定液配方如下(以 100 ml 固定液的量计):
A 液:2 g 多聚甲醛溶于 60℃ 的 40 ml 水中,将 2~6 滴 1mol/L 的 NaOH 慢慢滴入直到溶液变清亮。
B 液:25% 戊二醛 10 ml 与 0.2md/L 二甲砷酸钠 50 ml 混合,pH 值为 7.3。
使用前将两种液体贮存于 4L,使用时再混合为 100 ml 固定液。不同灌注方法的详细步骤也不相同,这里所采用的灌注法既简单又可靠,它能最大限度地减少开始麻醉和有效固定之间的时间。蠕动加压泵(Watson-MarlowMHRE200) 为灌注提供动力(也有许多作者用静水压作为动力),插管完毕后立即导入固定液。起初灌注液保持相对低的流速,出现固定液起效的征兆(四肢和尾巴伸展)后的短时间内应逐渐増加流速。固定过程持续大约 10 min,固定 1 只成年大鼠需要 500 ml 固定液。不需要额外地监测灌流时的压力。
插管用 21 G 皮下注射针制成,在中点处折弯,尖端磨平。将一滴环氧树脂滴于针尖的一侧,然后把它涂抹在针尖周围,以利于导管经左心室尖的切口插入升主动脉。插管后用动脉钳将插管和心脏夹在一起并置于适当的位置。在手术和插管过程中,蠕动加压泵应保持低速持续运转,以防止气泡进入血管。当插管固定于适当的位置后,立刻剪开右心房,同时加快泵转动的速度,导入固定液开始固定。
2.灌注完毕后,取出大脑并置于新鲜的固定液中。组织块或组织片应切得足够薄 (不超过 1 mm), 以利于四氧化锇渗透。四氧化锇后固定、脱水及包埋的步骤与上面例 1 所述相同。
二、切片
1.切片厚 1 um,甲苯胺蓝和派罗宁染色后用于初步观察和调整,方法同例 1。
2.用超薄切片机切取约 70~90nm 厚(呈银白-淡金黄色)的切片,将切片收集于涂有聚乙烯醇的铜网上,干燥后用枸橼酸铅和醋酸铀染色。
常见问题
结果
有人曾描述过小脑皮质内几种不同的突触类型,其中的大多数突触属于轴-树突触。我们在此仅简要地举三个例子:一个来自于分子层,另外两个来自于颗粒层内的突触小球。就突触而言,分子层内主要是颗粒细胞的平行纤维与 Purkinje 细胞的树突棘形成的突触联系。图 1-4A 所示为分子层最外层的水平切面,含有横切的平行纤维(pf)。可见几个由平行纤维与树突棘形成的突触(s),注意这些突触常与胶质细胞的突起形成紧密联系,而平行纤维(颗粒细胞的轴突)聚集在一起且缺乏胶质细胞形成的单个髓鞘。图 1-4B 是一个相同类型突触的放大像,它属于 Grayl 型突触,特别应该注意的是突触后膜增厚以及在突触前、后膜间有一薄层细胞外基质。突触前囊泡为圆形(rv)。图 1-4C 所示颗粒层内的一个突触小球,它是由一个位居中央的苔藓纤维(mf) 的玫瑰花瓣状终扣和周围的许多颗粒细胞的树突(gcd) 以及 Golgi 细胞的轴突形成的复杂结构。苔藓纤维和 Golgi 细胞轴突都与颗粒细胞的树突形成轴-树突触,但它们分别属于 Gray1 型和 Gray2 型突触。图 1-4D 凊楚地显示 Gdgi 细胞与颗粒细胞间的突触。突触后膜增厚远不如 Grayl 型突触明显,且突触前、后膜之间无明显的细胞外基质。许多突触前囊泡都属于扁平囊泡。以往的研究已经揭示平行纤维和苔藓纤维是兴奋性的,而 Golgi 细胞是抑制性的。
来源:丁香实验