正常大兔脑微血管内皮细胞的培养

实验材料：

1. 正常兔大脑皮质组织；

2. 不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. M199培养液（含20%小牛血清、肝素25U/ml、HEPES 10mmol/L、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素）；D-Hanks液；0.05%胰蛋白酶溶液；0.05%胶原酶溶液；15%右旋糖苷（用Hanks配制，pH7.4）；

4. 匀浆器、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械；

5. 离心管（15ml、50ml）

6. 网筛：110μm尼龙网筛

实验方法：

1. 通过颈动脉放血将兔处死，去头皮。将头颅取出并浸入75%的乙醇中，消毒约1min。在无菌状态下迅速取出兔大脑皮质。需小心剔除大血管和软脑膜；

2. 将脑皮质放入D-Hanks液中，漂洗数次后，将其剪碎。再移入含0.05%胰蛋白酶溶液的小瓶内，在37℃水浴中消化10—20min；

3. 用有血清培养液中止消化。置于玻璃研磨器内研磨，制成粗悬液。经孔径为110μm尼龙筛网过滤，将滤液以4000r/min离心10min；

4. 弃离心后的上清液。给沉淀加入15%右旋糖苷溶液，重新悬浮沉淀。然后，再以4000r/min离心20min。收集微血管片段；

5. 用0.05%胶原酶溶液消化2—4h。用Hanks液洗涤并离心，给微血管片段加入M199培养液；

6. 接种到培养瓶中，置37℃、5%CO₂ 的培养箱中（湿度100%）培养

7. 24h后换液，将未贴壁的微血管段移入其它培养瓶或皿中继续贴壁生长。之后，每3d换液一次，待细胞长至融合状态时，即可进行传代培养。