正常兔肺泡巨噬细胞的培养

实验材料：

1. 肺泡巨噬细胞来源：体重为2—3kg的成年兔。也可使用成年大鼠；

2. 灌洗液：不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.4；

3. 培养液：MEM培养液，添加谷氨酰胺1mmol/L、卡那霉素100µg/ml、青霉素200IU/ml、链霉素200µg/ml、HEPES 10mmol/L和10%胎牛血清；

4. 无菌手术器械：手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等；

实验方法：

1. 通过耳缘静脉给兔子快速注射约40ml空气致死；

2. 打开胸腔，暴露出气管的上段并分离四周的组织。用动脉钳夹紧气管，阻塞气管腔，防止血液由此进入肺。在气管结扎点的上端横切气管；

3. 将气管、肺和心脏整体移出胸腔。细心分离切除心脏。注意切勿损伤肺、气管及支气管、排除肺循环中的血液。用预温的生理盐水清洗肺表面，尽量洗净血液；

4. 用纱布轻轻抹干肺表面液体。用另一动脉钳牢固地夹住气管壁（注意不要堵塞气管腔），将肺悬挂在合适的支持物上；

5. 取下夹住气管腔的钳子。将预温至37℃的灌洗液30—40ml慢慢灌入气管，直到肺脏扩张。再夹紧气管，轻轻按摩肺脏；

6. 松开气管，将肺灌洗液倒入一个预冷的烧杯中。密封后暂存于4℃冰箱内；

7. 重复步骤5和步骤6

8. 混合2次取得的灌洗液。在4℃条件下离心（500g，5min）。用小口径毛细吸管小心吸弃细胞团与上清液之间的絮状物（主要为细胞碎片和粘液），再吸弃上清液；

9. 加入培养液，用吸管反复吹打，将细胞团制成细胞悬液。按常规法计数细胞。从每只正常兔的肺灌洗液中可获得大约2×107 个细胞。