正常大兔胆囊上皮细胞的培养

实验材料：

1.  2—3月龄的家兔胆囊；

2.  不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3.  培养用液：以DMEM/F12为基础培养基，添加10%的胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、2μg/ml胰岛素、10 ng/ml表皮生长因子以及100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。酶消化液为0.125%Ⅳ型胶原酶溶液。组织清洗液为DMEM培养液，并添加200 IU/ml青霉素和200μg/ml链霉素；也可使用无Ca²⁺ 、Mg²⁺ 的D-Hanks液作为组织清洗液。

4.  培养器具：用鼠尾胶原或胶原蛋白包被的25ml培养瓶或24孔培养板、无菌普通培养皿若干。手术刀、眼科剪、镊等；

实验方法：

1.  选用2—3月龄的家兔，以戊巴比妥钠麻醉，开腹取出肝脏并从中分离胆囊；

2.  排净胆囊中的胆汁，将胆囊切开，用组织清洗液反复洗净胆囊粘膜表面的胆汁和粘液；

3.  在普通培养皿底面滴加1—2ml的酶消化液，胆囊粘膜面朝下，与酶消化液相贴。置37℃下消化10—15min后，再将胆囊移入另一培养皿，粘膜面朝上，向上滴加10%胎牛血清DMEM/F12培养液，以终止消化；

4.  用眼科手术刀轻刮胆囊粘膜表面，一方面不断地将培养液滴在粘膜表面，另一方面用吸管收集消化刮落的细胞；

5.  将收集到的含消化酶的细胞悬液离心（1000r/min，5—7min）沉淀细胞，弃上清液。再加培养液将调节细胞密度至4×10⁴ —5×10⁴ 个/ml；

6.  直接在培养瓶或板上种植。于37℃、5%CO₂ 的培养箱中培养。4—7d后，待细胞贴壁，再每3d更换培养液1次；