正常动物胸腺上皮细胞的培养

实验材料：

1. 胸腺上皮细胞来源；一般取材小鼠或手术切取的儿童之胸腺；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 有血清培养液：可使用RPMI1640培养液，添加10%胎牛血清、谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠1mmol/L、非必需氨基酸1mmol/L、2-巯基乙醇（2-ME）5×10-5 mol/L、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml（Schreiber et al.1991）。也可以DMEM作为基础培养基；

4. 化学限定性培养液：基础培养液为DMEM，添加HDL100μg/ml、转铁蛋白50μg/ml、胰岛素5μg/ml、氢化可的松2.7×10-7 mol/L、EGF 10ng/ml、硒25 ng/ml以及三碘甲腺原氨酸（T3 ）1×10-10mol/L（Schreiber et al.1991）；

5. 消化液：原代培养时，从胸腺组织制备细胞悬液时，所用的消化液为1mg/ml的胶原酶，用含有15%胎牛血清的DMEM配制。传代时所用的消化液为0.02%EDTA-0.25%胰蛋白酶混合液；

6. 手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊，止血钳，无菌消毒手术器械；

7. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 若取材于小鼠，先将动物处死，用75%乙醇消毒。打开胸腔，取出胸腺。如果取材于手术切除的儿童胸腺，将所取胸腺组织置于含抗生素的平衡盐溶液中；

2. 将切取的胸腺组织尽可能去除表面的结缔组织被膜。将胸腺实质剪成约1mm3 大小的植块；

3. 用平衡盐溶液反复洗涤植块，以尽量洗去胸腺细胞；

4. 在37℃、5%CO2 的培养箱中，用胶原酶消化液消化约1.5h；

5. 在胶原酶消化液中，将组织块进一步剪碎；

6. 静置，待组织块下沉，弃去上清液。将组织块重新悬浮于无血清培养液中；

7. 重复步骤5可达3次；

8. 将植块接种于培养瓶或培养皿内，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。培养器皿可以用生长基质物质预先包被。在原代培养最初6d内，不更换培养液；

注意事项：

胸腺上皮细胞体外培养最大的问题是成纤维细胞的过度生长，故抑制成纤维细胞的生长是上皮细胞培养的成功的关键。