动物肠黏膜上皮细胞的培养

实验材料：

1. 动物胎体小肠黏膜或死亡胎儿的小肠黏膜

2. 1%Ⅳ胶原蛋白铺培养瓶，放超净工作台上干燥

3. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

4. 300000U/LⅪ型胶原酶和0.1g/LⅠ型中性蛋白酶混合消化液，DMEM配置

5. 解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

6. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 取妊娠17-19d胎鼠，放入70%乙醇中消毒1min。经腹正中切口取出小肠，放入预冷的PBS中。

2. 用PBS冲洗后，剪除肠系膜。纵行剪开肠壁，用PBS冲洗3次，洗去粘液。

3. 将肠壁剪成1mm3 左右的小块的组织块，放入20ml消化液中，37℃水浴中振荡消化30min。

4. 用吸管反复吹打组织块3-5min，然后以1000r/min，离心5min。吸去消化液后，加入PBS，反复吹打，悬浮沉淀的肠绒毛组织。在相差显微镜下观察可见单个黏膜上皮细胞或隐窝细胞团。

5. 将消化下来的细胞或细胞团加入分离管中，再加入分散液，吹打均匀，静置1min。然后，收集含细胞或细胞团的上清液。重复3-4次。

6. 将收集的上清液离心（1500r/min，5min）。用分散液将单个细胞和肠隐窝细胞团混悬，离心（1500r/min，5min），重复3-4次。

7. 用培养液混悬沉淀细胞，将细胞悬液加入培养皿或培养瓶中，放入37℃，含5%CO2 的孵箱中培养。

8. 48h后换培养液，以后每隔2-3d换液1次。