动物子宫颈部上皮细胞的培养

实验材料：

1. 动物子宫颈部穿刺或切除所得组织

2. 3T3成纤维细胞

3. 0.25%胰蛋白酶/EDTA

4. KCM：DMEM中添加10%FBS、0.5ug/ml氢化可的松和1×10-10 mol/L霍乱毒素

5. EGF：100ugEGF溶于1ml无菌的UPW中。按100ul分装，在-20℃条件下储存。用10ml的含有血清的培养液配制100ug/mlEGF工作液，按100ul分装，在4℃储存。使用时，用含有血清的培养液稀释（1：100）成最终浓度（10ng/ml）

6. CT：将1.18ml无菌的UPW加入1mg CT，配制成10-5 mol/L CT液，在4℃储存。将100ul 10-5 mol/L CT加入10ml含血清培养液中，制成工作液。过滤除菌后，在4℃储存。使用时，最终浓度为10-10 mol/L

7. 氢化可的松：将1mg氢化可的松溶解于1ml 50%乙醇（v/v，用蒸馏水配制）。然后，按100ul分装，在-20℃储存。最终浓度为0.5ug/ml

8. 不含Ca2+ 和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素，pH7.4

9. 解剖剪、解剖镊、眼科剪，眼科镊

10. 培养皿（直径60mm和90mm）

11. 离心管（15ml、50ml）

12. 照射源：X射线或 60Co

实验方法：

1. Swiss 3T3 成纤维细胞的准备

（1） 准备大量的3T3细胞，按1.5×104个/cm2 的细胞密度将3T3细胞接种入培养瓶内，用含有10%小牛血清的DMEM培养。24h后换液，每2-3d换液1次，4-5d传代。使用的细胞不超过20代。

（2） 为了避免轻度污染，将一瓶生长较好的细胞用无抗生素培养液培养。然后，在每代用这些细胞接种于该周所需要饲养细胞的培养瓶中。

（3） 通过 60 Gy X射线或 60 Co照射使饲养细胞灭活。被照射的3T3细胞在4℃条件下可存放3-4d。

（4） 在无照射源的条件下，用丝裂菌素C灭活饲养细胞。在37℃条件下，用400ug/ml丝裂菌素C处理单层3T3细胞1h。用胰蛋白酶消化丝裂菌素C处理过的细胞，混悬细胞，用含有血清的培养液洗细胞2次。然后，用完全培养液混悬细胞，调整细胞密度。

2. 从转运培养液中取出子宫颈部皮肤组织块，用5ml含有50ug/ml硫酸庆大霉素和5ug/ml两性霉素的无菌PBSA冲洗2-3次。将组织块放入培养皿，表皮面朝下，用一次性手术刀剥除肌肉和真皮，保留薄而不透明的表皮片，用眼科剪将表皮片剪碎至1cm3 大小。

3. 将剪碎的组织块转入无菌三角瓶内，加入15ml预先在37℃条件下预热的胰蛋白酶-EDTA液，将三角瓶移入恒温水浴振荡器内，37℃水浴中振荡消化45min。在室温条件下，将细胞悬液放置2-3min。取出细胞悬液，用不锈钢或塑料滤网滤入50ml离心管。然后加入10ml完全培养液。

4. 加入15ml预热的胰蛋白酶-EDTA液含有表皮小块的器皿，重复消化、过滤操作步骤2-3次。收集细胞悬液，以1000r/min，离心5min，吸去上清液，加入10ml完全培养液，充分混悬细胞。用血细胞计数板计数细胞，然后用台盼蓝拒染法估计细胞活力。

5. 用KCM稀释细胞悬液，将2×104 个/cm2 表皮细胞与1×105 个/cm2 致命灭活的3T3细胞同时放入培养皿。60mm培养皿，接种1×105 个/cm2 个表皮细胞和5×105 个/cm2 个被照射的3T3细胞。

6. 在37℃、5% CO2 条件下培养细胞。培养72h后，用添加10ng/ml EGF的培养液换液。在显微镜下检查细胞，确定加入足够的饲养细胞。如有必要，再加入饲养细胞。每周换液2次。8-12d，在显微镜下可见到角质形成细胞克隆。14-16d，肉眼下见到角质形成细胞克隆，此时应进行传代。