猪肺泡巨噬细胞的培养

1、细胞培养所用溶液及其配制

1×RPMI1640及：按照产品说明配制，过滤除菌，4℃保存备用。

新生牛血清：56℃灭活30min，-20℃保存备用。

2×104U/ml青、链霉素液（双抗）：青链霉素各2×106 U溶于100ml灭菌双蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

10×Na2EDTA-胰酶溶液（2.5%）：Na2EDTA 0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4.12H2O 2.89g，KH2PO4 0.2g，1%酚红溶液1.5ml，胰酶（1:250）2.5g，溶于100ml双蒸水中，NaOH调节pH至7.2~7.5，过滤除菌，分装，-20℃保存备用，使用时1∶10倍稀释。

7.5%NaHCO3： 7.5g NaHCO3溶于100ml双蒸水中，115℃高压灭菌15min，置4℃冰箱冷藏备用。

10% RPMI1640营养液：于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清，按照1% 比例加入2×104U/ml双抗，用7.5% NaHCO3或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。

2、将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1~2min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。

将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，用单层无菌100目不锈钢筛过滤，收集全部灌洗液，2000r/min离心10min，收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞，置培养瓶或培养皿中于37C CO2培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。