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猪显微受精技术

相关实验:猪显微受精技术

最新修订时间:

简介

显微受精技术又称显微操作辅助受精技术,是 20 世纪 80 年代发展起来的一种体外受精技术。该技术通过显微操作仪修饰卵子透明带,或将精子或精细胞直接注入卵子内部,辅助其完成与卵子的受精过程。目前有透明带修饰和精子注入两种方式,前者包括透明带钻孔法(zona drilling,ZD)和透明带切口法(partial zona dissection,PZD),后者包括透明带下注射法(subzonal insemination,SUZI)和胞质内注射法(ICSI)。

材料与仪器

器材:

① 恒温水浴

② 震荡仪

③ 拉针仪

④ 培养平皿

⑤ 1.5 ml 离心管、 17 ℃ 冰箱

⑥ 显微操作仪

试剂:

① 材料:猪

② DPBS、TritonX-100、Tween

③ PVA

④ 多聚甲醛

⑤ Hepes

⑥ DMSO、NaOH、HCL

⑦ 甘露醇

⑧ Caleium ionophore A23187

⑨ PZM-3 胚胎培养液

步骤

猪体外受精技术的基本过程可分为如下几步:

(一)主要试剂的配制


1. DPBS 一瓶 DPBS 粉剂(Sigma)溶于 1 L 去离子水中。0.22 μm 滤膜过滤,置于 4 ℃ 备用。

2. DPBS-PVA 用 90 ml 去离子水加热溶解 0.1 g PVA,PVA 溶解后冷却至室温,再加 10 ml 10 倍浓储 DPBS。

3. 清洗液 10 ml DPBS-PVA 中加入 10 μl 10% TritonX-100 的 DPBS-PVA 和 10 μl Tween。置于 4 ℃ 备用。

4. 透膜液 9 ml DPBS-PVA 中加入 1 ml 10% Triton X-100 的 DPBS-PVA。置于 4 ℃ 备用。

5. 4% 多聚甲醛(固定液)4.5 ml 去离子水加入 0.2 g 多聚甲醛,加热到 60~70 ℃ 开始搅拌,同时加入 200 μl 1 mol/LNaOH,搅拌至粉末溶解,冷却后加入 200 μl 1 mol/L HCI。最后再加入 0.5 ml 10 倍浓储 DPBS。现用现配。

6. Sμmol/LCaleium ionophore A23187 用 DMSO 溶解 Caleium ionophore A23187,然后加入到 PZM-3 胚胎培养液中,终浓度是 5 μmol/L。

7. 1.9 mmol/L 6-DMAP 用 DMSO 溶解 6-DMAP,然后加入到 PZM-3 胚胎培养液中,终浓度是 1.9 μmol/L。

8. 电激活液 5.46 g 甘露醇,0.015 g CaCl2 · 2H20,0.002 g MgCl2 · 6 H20,0.013 g Hepes,溶于 100 ml 去离子水 中。0.22 μm 滤膜过滤,置于 4℃ 备用。

(二)显微操作针的制备


(1)注射针的制备:调节拉针仪参数,将外径为 1 mm 的毛细玻璃拉成所需的理想针形。将针管固定在煅针仪上,在玻璃针外径 7~9 μm 处断针。在磨针仪上将针管口磨出 35°斜面,在磨石上先加一些水,使针管中保留一些水,把针磨成斜面。针磨好后在 2.5% 的 HF 中清洗内外管壁,然后再用去离子水清洗儿遍。将清洗好的针在煅针仪上拔尖,先加热玻璃球,将玻璃针最尖端接触玻璃球,当针尖稍微有些熔化,迅速拉开,好的注射针尖应该是短而锐利。将玻璃针调到玻璃球上方不接触,加热玻璃球,玻璃针管弯区到 30°停止。

(2)固定针的制备:调节拉针仪参数,将外径为 1 mm 的毛细玻璃拉成所需的理想针形。用磨石片在拉制好的玻璃针外径 120~180 μm 处断针,针口要平齐。然后将玻璃针口靠近玻璃球,间隔一段距离,加热玻璃球发红,使针口缩到 20 μm 时停止加热。将固定管弯成 30°。

(三)卵母细胞的采集


(1)抽卵:使用 10 号针头的 10 ml 注射器,抽取直径 2-8 mm 卵泡中的 COCs,注意针口向下,如抽针的同时抬活塞吸尽卵泡中的卵泡液。抽取的卵泡液置 50 ml 尖底离心管中 37 ℃ 恒温水浴,尽量于 0.5 小时内抽完。

(2)洗卵:抽卵后将离心管置于温箱中,首次沉降 10 分钟,弃上层卵泡液后加入 TL-HEPES 洗涤,摇晃,置温箱沉降 3 分钟,弃上层液体,重复洗涤 2 次,第 3 次加入 TL-HEPES 后倒入国产大平皿中,准备捡卵。

弃上层卵泡液方法:用 10 ml 注射器吸取,较上层时可以快速吸,到接近沉降物时慢速吸,以防止抽到沉降物。

期间准备国产大平皿(底部预先划上间距 1 cm 左右的刻线),并附一国产小平皿,小平皿中添加 TL-HEPES 液。

注:因 TL-HEPES 用量大,洗涤时倒入约离心管 30 ml 处即可。

(3)捡卵:在 1 倍下挑选含有至少 3 层完整卵丘细胞的 COCs,置于上述准备的小平皿中。注意区分死卵、裸卵和形态不规则或胞质不均匀的卵。

(四)卵母细胞体外成熟培养


挑取的 COCs 经 4 滴成熟液洗涤后置于充分平衡(3~4 小时)的 24 孔培养板中培养,每孔加成熟培养液 500μl,上覆液体石蜡,每孔培养 50 个 COCs 为宜。培养条件为 38.5 ℃、5% CO2、 95% 空气、饱和湿度。24 孔板标记:培养时间、卵数、培养者等。

(五)精子准备


17 ℃ 保存猪精液,置于 39 ℃ 温箱中孵育 20 分钟复苏精子,离心(1500 r/min,5 分钟),弃上清液,加入含有 0.1% PVA 的 DPBS(DPBS-PVA)悬浮沉淀,重复离心,弃上清液,待用。依据实验设计,不同方法预处理精子:


① 活精子:精子沉淀用 PBS-PVA 悬浮,转移至精子操作滴中。


② 0.1% Triton X-100 处理精子:精子沉淀用含 0.1% Triton X-100 和 0.3% BSA 的 PBS-PVA 悬浮,然后离心沉淀,PBS-PVA 悬浮。


③ 液氮一次冻融:精子沉淀用含 5% BSA 的 BTS 悬浮。将铜网置于液氮面,在铜网上直接滴冻,每个颗粒 100 μl。37 ℃ 水浴解冻,离心.PBS-PVA 悬浮。


(六)卵母细胞胞质内单精子注射


利用显微操作仪对猪成熟卵母细胞进行 ICSI 操作。将注射管和固定管安装在显微操作仪上。在 60 mm 培养平皿中央做一个 100 μl TL-HEPES 滴,用于放卵和进行显微注射。在滴两旁再做两组 10 μl DPBS-PVA 滴,用于放置精子。覆盖液体石蜡。每批操作 20-30 个卵子。用固定管固定卵母细胞,调整卵母细胞的第一极体位置,使之位于相当于时针「6」或「12」点的位置,注射针从「3」点的位置穿透透明带,向「9」点方向深人,回吸少量卵胞质使卵质膜被穿破,然后将单个精子和微量操作液注人胞质。注射完毕,缓慢撤出注射针,并释放卵母细胞。


(七)ICSI 卵母细胞激活处理


注射卵在胚胎培养液滴中洗 3 遍后置于培养箱中培养 30 分钟,再依据实验设计对注射卵采用不同的辅助激活方法处理:


① Calcium ionophore A23187:5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟;


② Calcium ionophore A23187 + 6-DMAP:5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟,然后在胚胎培养液滴中洗去钙离子载体,转移到一新的培养滴中培养 4 小时,再用 1.9 mmol/L 6-DMAP 处理 3 小时;


③ 电激活:采用 1.2 kV/cm,30 微秒,2 次直流电(DC)脉冲。


(八)胚胎体外培养、发育率计算


猪 ICSI 卵母细胞培养于 PZM-3 胚胎培养液中,培养条件为 38.5 ℃、5% CO2、95% 空气,饱和湿度。依据实验设计 ICSI 卵母细胞,在添加 1.71 mmol/L 半胱氨酸的 PZM-3 培养液中分别培养 0 小时(对照组)、4 小时、12 小时和 168 小时,然后转移到不含半胱氨酸的 PZM-3 中继续培养。第 2 天统计卵裂胚胎数,第 7 天统计囊胚数。


(九)ICSI 卵母细胞中原核形成情况的观察


ICSI 卵母细胞培养 15 小时后移入 4% 多聚甲醛固定液中固定 45 分钟,清洗液清洗,透膜液中放置 1 小时,之后在 10 mg/L Hoechst 33342 的 DPBS-PVA 中行荧光避光染色 10 分钟,清洗液中清洗 10 分钟,在载玻片上做 10 μl 的抗荧光淬灭剂滴,将染色后的 ICSI 卵母细胞转移到载玻片上的滴中,盖上盖玻片,使用指甲油封片。在荧光显微镜下观察原核形成情况。以 1 雄原核 + 1 雌原核 + 2 极体(1MPN + 1FPN + 2PB)为正常受精标准,按原核形成类型分组记录各种类型胚胎数。

来源:丁香实验

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