简介
显微受精技术又称显微操作辅助受精技术,是 20 世纪 80 年代发展起来的一种体外受精技术。该技术通过显微操作仪修饰卵子透明带,或将精子或精细胞直接注入卵子内部,辅助其完成与卵子的受精过程。目前有透明带修饰和精子注入两种方式,前者包括透明带钻孔法(zona drilling,ZD)和透明带切口法(partial zona dissection,PZD),后者包括透明带下注射法(subzonal insemination,SUZI)和胞质内注射法(ICSI)。
材料与仪器
步骤
(一)主要试剂的配制
(二)显微操作针的制备
(三)卵母细胞的采集
(四)卵母细胞体外成熟培养
(五)精子准备
17 ℃ 保存猪精液,置于 39 ℃ 温箱中孵育 20 分钟复苏精子,离心(1500 r/min,5 分钟),弃上清液,加入含有 0.1% PVA 的 DPBS(DPBS-PVA)悬浮沉淀,重复离心,弃上清液,待用。依据实验设计,不同方法预处理精子:
① 活精子:精子沉淀用 PBS-PVA 悬浮,转移至精子操作滴中。
② 0.1% Triton X-100 处理精子:精子沉淀用含 0.1% Triton X-100 和 0.3% BSA 的 PBS-PVA 悬浮,然后离心沉淀,PBS-PVA 悬浮。
③ 液氮一次冻融:精子沉淀用含 5% BSA 的 BTS 悬浮。将铜网置于液氮面,在铜网上直接滴冻,每个颗粒 100 μl。37 ℃ 水浴解冻,离心.PBS-PVA 悬浮。
(六)卵母细胞胞质内单精子注射
利用显微操作仪对猪成熟卵母细胞进行 ICSI 操作。将注射管和固定管安装在显微操作仪上。在 60 mm 培养平皿中央做一个 100 μl TL-HEPES 滴,用于放卵和进行显微注射。在滴两旁再做两组 10 μl DPBS-PVA 滴,用于放置精子。覆盖液体石蜡。每批操作 20-30 个卵子。用固定管固定卵母细胞,调整卵母细胞的第一极体位置,使之位于相当于时针「6」或「12」点的位置,注射针从「3」点的位置穿透透明带,向「9」点方向深人,回吸少量卵胞质使卵质膜被穿破,然后将单个精子和微量操作液注人胞质。注射完毕,缓慢撤出注射针,并释放卵母细胞。
(七)ICSI 卵母细胞激活处理
注射卵在胚胎培养液滴中洗 3 遍后置于培养箱中培养 30 分钟,再依据实验设计对注射卵采用不同的辅助激活方法处理:
① Calcium ionophore A23187:5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟;
② Calcium ionophore A23187 + 6-DMAP:5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟,然后在胚胎培养液滴中洗去钙离子载体,转移到一新的培养滴中培养 4 小时,再用 1.9 mmol/L 6-DMAP 处理 3 小时;
③ 电激活:采用 1.2 kV/cm,30 微秒,2 次直流电(DC)脉冲。
(八)胚胎体外培养、发育率计算
猪 ICSI 卵母细胞培养于 PZM-3 胚胎培养液中,培养条件为 38.5 ℃、5% CO2、95% 空气,饱和湿度。依据实验设计 ICSI 卵母细胞,在添加 1.71 mmol/L 半胱氨酸的 PZM-3 培养液中分别培养 0 小时(对照组)、4 小时、12 小时和 168 小时,然后转移到不含半胱氨酸的 PZM-3 中继续培养。第 2 天统计卵裂胚胎数,第 7 天统计囊胚数。
(九)ICSI 卵母细胞中原核形成情况的观察
ICSI 卵母细胞培养 15 小时后移入 4% 多聚甲醛固定液中固定 45 分钟,清洗液清洗,透膜液中放置 1 小时,之后在 10 mg/L Hoechst 33342 的 DPBS-PVA 中行荧光避光染色 10 分钟,清洗液中清洗 10 分钟,在载玻片上做 10 μl 的抗荧光淬灭剂滴,将染色后的 ICSI 卵母细胞转移到载玻片上的滴中,盖上盖玻片,使用指甲油封片。在荧光显微镜下观察原核形成情况。以 1 雄原核 + 1 雌原核 + 2 极体(1MPN + 1FPN + 2PB)为正常受精标准,按原核形成类型分组记录各种类型胚胎数。
来源:丁香实验