猪显微受精技术

（一）主要试剂的配制

1. DPBS 一瓶 DPBS 粉剂（Sigma）溶于 1 L 去离子水中。0.22 μm 滤膜过滤，置于 4 ℃ 备用。

2. DPBS-PVA 用 90 ml 去离子水加热溶解 0.1 g PVA，PVA 溶解后冷却至室温，再加 10 ml 10 倍浓储 DPBS。

3. 清洗液 10 ml DPBS-PVA 中加入 10 μl 10％ TritonX-100 的 DPBS-PVA 和 10 μl Tween。置于 4 ℃ 备用。

4. 透膜液 9 ml DPBS-PVA 中加入 1 ml 10％ Triton X-100 的 DPBS-PVA。置于 4 ℃ 备用。

5. 4％多聚甲醛（固定液）4.5 ml 去离子水加入 0.2 g 多聚甲醛，加热到 60～70 ℃ 开始搅拌，同时加入 200 μl 1 mol/LNaOH，搅拌至粉末溶解，冷却后加入 200 μl 1 mol/L HCI。最后再加入 0.5 ml 10 倍浓储 DPBS。现用现配。

6. Sμmol/LCaleium ionophore A23187 用 DMSO 溶解 Caleium ionophore A23187，然后加入到 PZM-3 胚胎培养液中，终浓度是 5 μmol/L。

7. 1.9 mmol/L 6-DMAP 用 DMSO 溶解 6-DMAP，然后加入到 PZM-3 胚胎培养液中，终浓度是 1.9 μmol/L。

8. 电激活液 5.46 g 甘露醇，0.015 g CaCl2 · 2H20，0.002 g MgCl2 · 6 H20，0.013 g Hepes，溶于 100 ml 去离子水中。0.22 μm 滤膜过滤，置于 4℃ 备用。

（二）显微操作针的制备

（1）注射针的制备：调节拉针仪参数，将外径为 1 mm 的毛细玻璃拉成所需的理想针形。将针管固定在煅针仪上，在玻璃针外径 7～9 μm 处断针。在磨针仪上将针管口磨出 35°斜面，在磨石上先加一些水，使针管中保留一些水，把针磨成斜面。针磨好后在 2.5％的 HF 中清洗内外管壁，然后再用去离子水清洗儿遍。将清洗好的针在煅针仪上拔尖，先加热玻璃球，将玻璃针最尖端接触玻璃球，当针尖稍微有些熔化，迅速拉开，好的注射针尖应该是短而锐利。将玻璃针调到玻璃球上方不接触，加热玻璃球，玻璃针管弯区到 30°停止。

（2）固定针的制备：调节拉针仪参数，将外径为 1 mm 的毛细玻璃拉成所需的理想针形。用磨石片在拉制好的玻璃针外径 120～180 μm 处断针，针口要平齐。然后将玻璃针口靠近玻璃球，间隔一段距离，加热玻璃球发红，使针口缩到 20 μm 时停止加热。将固定管弯成 30°。

（三）卵母细胞的采集

（1）抽卵：使用 10 号针头的 10 ml 注射器，抽取直径 2-8 mm 卵泡中的 COCs，注意针口向下，如抽针的同时抬活塞吸尽卵泡中的卵泡液。抽取的卵泡液置 50 ml 尖底离心管中 37 ℃ 恒温水浴，尽量于 0.5 小时内抽完。

（2）洗卵：抽卵后将离心管置于温箱中，首次沉降 10 分钟，弃上层卵泡液后加入 TL-HEPES 洗涤，摇晃，置温箱沉降 3 分钟，弃上层液体，重复洗涤 2 次，第 3 次加入 TL-HEPES 后倒入国产大平皿中，准备捡卵。

弃上层卵泡液方法：用 10 ml 注射器吸取，较上层时可以快速吸，到接近沉降物时慢速吸，以防止抽到沉降物。

期间准备国产大平皿（底部预先划上间距 1 cm 左右的刻线），并附一国产小平皿，小平皿中添加 TL-HEPES 液。

注：因 TL-HEPES 用量大，洗涤时倒入约离心管 30 ml 处即可。

（3）捡卵：在 1 倍下挑选含有至少 3 层完整卵丘细胞的 COCs，置于上述准备的小平皿中。注意区分死卵、裸卵和形态不规则或胞质不均匀的卵。

（四）卵母细胞体外成熟培养

挑取的 COCs 经 4 滴成熟液洗涤后置于充分平衡（3～4 小时）的 24 孔培养板中培养，每孔加成熟培养液 500μl，上覆液体石蜡，每孔培养 50 个 COCs 为宜。培养条件为 38.5 ℃、5％ CO₂、 95％空气、饱和湿度。24 孔板标记：培养时间、卵数、培养者等。

（五）精子准备

17 ℃ 保存猪精液，置于 39 ℃ 温箱中孵育 20 分钟复苏精子，离心（1500 r/min，5 分钟），弃上清液，加入含有 0.1％ PVA 的 DPBS（DPBS-PVA）悬浮沉淀，重复离心，弃上清液，待用。依据实验设计，不同方法预处理精子：

① 活精子：精子沉淀用 PBS-PVA 悬浮，转移至精子操作滴中。

② 0.1％ Triton X-100 处理精子：精子沉淀用含 0.1％ Triton X-100 和 0.3％ BSA 的 PBS-PVA 悬浮，然后离心沉淀，PBS-PVA 悬浮。

③ 液氮一次冻融：精子沉淀用含 5％ BSA 的 BTS 悬浮。将铜网置于液氮面，在铜网上直接滴冻，每个颗粒 100 μl。37 ℃ 水浴解冻，离心．PBS-PVA 悬浮。

（六）卵母细胞胞质内单精子注射

利用显微操作仪对猪成熟卵母细胞进行 ICSI 操作。将注射管和固定管安装在显微操作仪上。在 60 mm 培养平皿中央做一个 100 μl TL-HEPES 滴，用于放卵和进行显微注射。在滴两旁再做两组 10 μl DPBS-PVA 滴，用于放置精子。覆盖液体石蜡。每批操作 20-30 个卵子。用固定管固定卵母细胞，调整卵母细胞的第一极体位置，使之位于相当于时针「6」或「12」点的位置，注射针从「3」点的位置穿透透明带，向「9」点方向深人，回吸少量卵胞质使卵质膜被穿破，然后将单个精子和微量操作液注人胞质。注射完毕，缓慢撤出注射针，并释放卵母细胞。

（七）ICSI 卵母细胞激活处理

注射卵在胚胎培养液滴中洗 3 遍后置于培养箱中培养 30 分钟，再依据实验设计对注射卵采用不同的辅助激活方法处理：

① Calcium ionophore A23187：5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟；

② Calcium ionophore A23187 ＋ 6-DMAP：5 μmol/L 钙离子载体激活处理 5 分钟，然后在胚胎培养液滴中洗去钙离子载体，转移到一新的培养滴中培养 4 小时，再用 1.9 mmol/L 6-DMAP 处理 3 小时；

③ 电激活：采用 1.2 kV/cm，30 微秒，2 次直流电（DC）脉冲。

（八）胚胎体外培养、发育率计算

猪 ICSI 卵母细胞培养于 PZM-3 胚胎培养液中，培养条件为 38.5 ℃、5％ CO₂、95％空气，饱和湿度。依据实验设计 ICSI 卵母细胞，在添加 1.71 mmol/L 半胱氨酸的 PZM-3 培养液中分别培养 0 小时（对照组）、4 小时、12 小时和 168 小时，然后转移到不含半胱氨酸的 PZM-3 中继续培养。第 2 天统计卵裂胚胎数，第 7 天统计囊胚数。

（九）ICSI 卵母细胞中原核形成情况的观察

ICSI 卵母细胞培养 15 小时后移入 4％多聚甲醛固定液中固定 45 分钟，清洗液清洗，透膜液中放置 1 小时，之后在 10 mg/L Hoechst 33342 的 DPBS-PVA 中行荧光避光染色 10 分钟，清洗液中清洗 10 分钟，在载玻片上做 10 μl 的抗荧光淬灭剂滴，将染色后的 ICSI 卵母细胞转移到载玻片上的滴中，盖上盖玻片，使用指甲油封片。在荧光显微镜下观察原核形成情况。以 1 雄原核＋ 1 雌原核＋ 2 极体（1MPN ＋ 1FPN ＋ 2PB）为正常受精标准，按原核形成类型分组记录各种类型胚胎数。

来源：丁香实验