原理
材料与仪器
灭菌CCM含0.2μg ml两性霉素B(两性霉素B洗剂) 非灭菌0.85%台盼蓝盐溶液 PBSA
聚丙烯离心管 15 ml或50 ml 塑料组织培养Petri培养皿 直径15 cm 改良的Neubauer血细胞计数器
步骤
(a)从一根股骨所得的骨髓悬液中取出10μL,与l0μL台盼蓝混合。评估存活率,确保髙于80%。
(b)1000 g离心10 min沉淀骨髓。
(c)用25 ml预热的含抗真菌药物的CCM重悬骨髓(处理大鼠骨髓细胞使用抗真菌药物,人骨髓细胞不使用)。
(d)将25 ml细胞悬液加人到15 cm直径的组织培养板中,37℃,5% CO2环境下至少孵育15 h。
(e)从培养箱中取出培养板,吸出培养基。
(f)用20 ml预热的PBSA润洗单层细胞。重复润洗过程3次,将最后的洗涤产物加人30 ml预热的含抗菌药物的新鲜CCM中(只有大鼠细胞使用抗真菌药物)。
(g)如有需要每隔两天重复步骤(f)维持6〜14天。
(h)每3天用倒置显微镜观察单层细胞。贴壁、成纤维细胞样的MSCs集落可以在培养板中清晰可见。某些情况下,这可能是造血细胞污染的信号,但这些细胞随着细胞传代过程可被去除。当培养物达到40%〜50%汇合时进行处理。这些MSCs标记为0代。
来源:丁香实验