原理
收集胚胎，除去绒毛膜，用胰蛋白酶分散胚胎细胞，然后在胚胎成纤维细胞饲养层上培养从斑马鱼囊胚和原肠期胚获得的原代细胞。
材料与仪器
链酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 胚胎成纤维细胞饲养层 人重组白血病抑制因子
LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液 稀漂白剂
LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液 稀漂白剂
步骤
鳟鱼胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系，在 10°C 条件下饲养，或者受精后 3 天的斑马鱼，在 28°C 条件下饲养），在 -80°C 条件下冻存
(b)为了制备提取物，将约 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 匀浆器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在 4°C 条件下离心（20000 g，30 min )
(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入 1 只新离心管，按操作步骤（c ) 离心
(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在 4°C 条件下超速离心（100000 g，60 min )
(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液，然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤
(i)将提取物按 0.5 ml 分装后，在 -80°C 条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案 21.4 )，然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏，最长 2 个月
BRL 细胞条件培养液：
(a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞（ATCC )
(b)当细胞汇合时，用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液，在 37°C 条件下培养
(c)5 天后吸出 LDF，过滤，在 -20°C 冻存
(d)向细胞中加入新鲜的 LDF，5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合
1. 在中襄胚或早原肠胚期收集胚胎，用清洁水浸洗数次。
2. 浸洗后将胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 个/皿）。然后，将皮氏皿放入层流通风橱中，在无菌条件下放置。
3. 将胚胎放入稀漂白剂中浸泡 2 min，然后用无菌的 Holtfreter 缓冲液浸洗数次。
4. 用 2 ml 链酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min，使胚胎去绒毛膜。然后，将胚胎在皮氏皿中轻轻搅动，使胚胎与部分消化的绒毛膜分离。
5. 将培养皿倾斜，以便从一侧收集胚胎，用巴斯德吸管轻轻吸出 1.5 ml 链酶蛋白酶溶液。为了防止去绒毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿倾斜，以便胚胎悬浮在剩余的链酶蛋白酶溶液中。
6. 加入 2 ml Holtfreter 缓冲液，轻轻搅动，以便轻轻浸洗胚胎。
7. 将皮氏皿倾斜，吸去大部分 Holtfreter 缓冲液，将胚胎悬浮在约 0.5 ml 缓冲液中。
8. 重复浸洗步骤两次以上。
9. 在最后 1 次浸洗后，将胚胎悬浮在 0.5 ml Holtfreter 缓冲液中，然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液。
10. 用胰蛋白酶将胚胎孵育 1 min，然后通过用吸管轻轻吹打 3~4 次分离细胞。
11. 将细胞悬液立即移入无菌的聚丙烯离心管中，然后加入 200 μl FBS，以终止胰蛋白酶的消化作用。
12. 通过离心（500 g， 5 min ) 收集细胞，然后用无 FBS 或鳟鱼血清的 LDF 原代培养液混悬细胞。
13. 将细胞以 1×104 个/cm2 的细胞密度种植到含有生长抑制的成纤维细胞饲养层的多孔培养板或培养瓶中。
14. 在加入 FBS 或鳟鱼血清前让细胞附着于饲养层（约 15 min )。在培养液中使用 10 ng/ml 人重组 LIF，此优于 BRL 条件培养液 [Sun et al.，1995a，1995b ]。
(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系，在 10°C 条件下饲养，或者受精后 3 天的斑马鱼，在 28°C 条件下饲养），在 -80°C 条件下冻存
(b)为了制备提取物，将约 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 匀浆器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在 4°C 条件下离心（20000 g，30 min )
(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入 1 只新离心管，按操作步骤（c ) 离心
(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在 4°C 条件下超速离心（100000 g，60 min )
(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液，然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤
(i)将提取物按 0.5 ml 分装后，在 -80°C 条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案 21.4 )，然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏，最长 2 个月
BRL 细胞条件培养液：
(a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞（ATCC )
(b)当细胞汇合时，用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液，在 37°C 条件下培养
(c)5 天后吸出 LDF，过滤，在 -20°C 冻存
(d)向细胞中加入新鲜的 LDF，5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合
1. 在中襄胚或早原肠胚期收集胚胎，用清洁水浸洗数次。
2. 浸洗后将胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 个/皿）。然后，将皮氏皿放入层流通风橱中，在无菌条件下放置。
3. 将胚胎放入稀漂白剂中浸泡 2 min，然后用无菌的 Holtfreter 缓冲液浸洗数次。
4. 用 2 ml 链酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min，使胚胎去绒毛膜。然后，将胚胎在皮氏皿中轻轻搅动，使胚胎与部分消化的绒毛膜分离。
5. 将培养皿倾斜，以便从一侧收集胚胎，用巴斯德吸管轻轻吸出 1.5 ml 链酶蛋白酶溶液。为了防止去绒毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿倾斜，以便胚胎悬浮在剩余的链酶蛋白酶溶液中。
6. 加入 2 ml Holtfreter 缓冲液，轻轻搅动，以便轻轻浸洗胚胎。
7. 将皮氏皿倾斜，吸去大部分 Holtfreter 缓冲液，将胚胎悬浮在约 0.5 ml 缓冲液中。
8. 重复浸洗步骤两次以上。
9. 在最后 1 次浸洗后，将胚胎悬浮在 0.5 ml Holtfreter 缓冲液中，然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液。
10. 用胰蛋白酶将胚胎孵育 1 min，然后通过用吸管轻轻吹打 3~4 次分离细胞。
11. 将细胞悬液立即移入无菌的聚丙烯离心管中，然后加入 200 μl FBS，以终止胰蛋白酶的消化作用。
12. 通过离心（500 g， 5 min ) 收集细胞，然后用无 FBS 或鳟鱼血清的 LDF 原代培养液混悬细胞。
13. 将细胞以 1×104 个/cm2 的细胞密度种植到含有生长抑制的成纤维细胞饲养层的多孔培养板或培养瓶中。
14. 在加入 FBS 或鳟鱼血清前让细胞附着于饲养层（约 15 min )。在培养液中使用 10 ng/ml 人重组 LIF，此优于 BRL 条件培养液 [Sun et al.，1995a，1995b ]。
来源：丁香实验
