细胞系

链酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA ZEM-2细胞（或等同物）
LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液

鳟鱼胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系，在 10°C 条件下饲养，或者受精后 3 天的斑马鱼，在 28°C 条件下饲养），在 -80°C 条件下冻存

(b)为了制备提取物，将约 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 匀浆器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min

(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在 4°C 条件下离心（20000 g，30 min )

(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层

(e)将上清液移入 1 只新离心管，按操作步骤（c ) 离心

(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在 4°C 条件下超速离心（100000 g，60 min )

(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液，然后过滤除菌

(h)提取物过一系列滤器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤

(i)将提取物按 0.5 ml 分装后，在 -80°C 条件下冻存

(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案 21.4 )，然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度

(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏，最长 2 个月

BRL 细胞条件培养液：

(a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞（ATCC )

(b)当细胞汇合时，用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液，在 37°C 条件下培养

(c)5 天后吸出 LDF，过滤，在 -20°C 冻存

(d)向细胞中加入新鲜的 LDF，5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合

1. 用 LDF 维持培养液培养从早期斑马鱼胚胎获得的细胞如 ZEM-2，至约 70% 汇合。

2. 在 26°C 和环绕空气的条件下培养细胞。

3. 约每 5 天换培养液1 次。

4. 经胰蛋白酶消化，继代培养（见方案13.2 )。

已表明鳟鱼血清和胚胎提取物剌激其他鱼类胚细胞的生长 [ Cdlodi and Bames,1990 ] 。