原理
通过用链酶蛋白酶除去绒毛膜、用添加成分的 FGF 培养液培养细胞和采用不同的胰蛋白酶消化筛选成纤维细胞,用原肠胚期斑马龟的胚胎成纤维细胞制备饲养层 [ Sun et al., 1995a ]。
材料与仪器
链酶蛋白酶E 用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA 受精后8h的胚胎 FBS
LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液
培养瓶
LDF基础培养液 LDF原代培养液 LDF维持培养液 D培养液 Holtfreter缓冲液
培养瓶
步骤
鳟鱼胚胎提取物:
(a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系,在 10°C 条件下饲养,或者受精后 3 天的斑马鱼,在 28°C 条件下饲养),在 -80°C 条件下冻存
(b)为了制备提取物,将约 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 匀浆器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜,然后在 4°C 条件下离心(20000 g,30 min )
(d)离心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入 1 只新离心管,按操作步骤(c ) 离心
(f)收集上清液,留下剩余的脂质,然后在 4°C 条件下超速离心(100000 g,60 min )
(g)超速离心后收集上清液,留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液,然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤
(i)将提取物按 0.5 ml 分装后,在 -80°C 条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞,测量蛋白质浓度(见方案 21.4 ),然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏,最长 2 个月
BRL 细胞条件培养液:
(a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞(ATCC )
(b)当细胞汇合时,用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液,在 37°C 条件下培养
(c)5 天后吸出 LDF,过滤,在 -20°C 冻存
(d)向细胞中加入新鲜的 LDF,5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后,将细胞分开培养,使细胞再次汇合
1. 收集约 30 个受精后 8 h 的胚胎。
2. 通过链酶蛋白酶处理,除去绒毛膜 [ Sun et al.,1995a ]。
3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min,同时用吸管轻轻吹打,以便使细胞分散。
4. 加入 FBS (终浓度为 10 % ) ,终止胰蛋白酶的消化。
5. 离心(500 g ,10 min ) ,收集细胞。
6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培养液混悬细胞,然后将细胞移入 25 cm2 培养瓶。
7. 在 26°C 条件下,让细胞贴壁和汇合。
8. 当细胞汇合时,用同样的培养液传代。
9. 培养 2~3 代后,上皮细胞和成纤维细胞将混合出现。这些细胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基础培养液维持培养。通过不同的胰蛋白酶消化,为下一步培养筛选成纤维细胞。
(a)用胰蛋白酶处理细胞 1 min 以除去大部分成纤维细胞,保留贴在瓶壁上的上皮细胞。
(b)将成纤维细胞移入另 1 个培养瓶。当细胞汇合时,重复以上过程。
(c)培养 2~3 代后,细胞均为成纤维细胞。
10. 制备生长抑制的成纤维细胞饲养层:
(a)将细胞加入合适的培养皿或培养瓶,使成纤维细胞生长成为汇合的单层。
(b)将 10 μg/ml 丝裂霉素 C 加入成纤维细胞中,在 26°C 条件下处理 3 h。
(c)用 LDF 浸洗 3 次后,可将生长抑制的成纤维细胞用作斑马鱼胚细胞培养的伺养层。
(a)收集胚胎(受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鳟鱼种系,在 10°C 条件下饲养,或者受精后 3 天的斑马鱼,在 28°C 条件下饲养),在 -80°C 条件下冻存
(b)为了制备提取物,将约 150 g 胚胎融化后,采用 Tissuemizer 匀浆器(Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上匀浆 2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜,然后在 4°C 条件下离心(20000 g,30 min )
(d)离心后收集上清液,留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入 1 只新离心管,按操作步骤(c ) 离心
(f)收集上清液,留下剩余的脂质,然后在 4°C 条件下超速离心(100000 g,60 min )
(g)超速离心后收集上清液,留下脂层。用 LDF (1 : 10 ) 稀释上清液,然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器(1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )过滤
(i)将提取物按 0.5 ml 分装后,在 -80°C 条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞,测量蛋白质浓度(见方案 21.4 ),然后用 LDF 将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在 4°C 条件下冷藏,最长 2 个月
BRL 细胞条件培养液:
(a)在 37°C 条件下和在 75 cm2 培养瓶中,用 DMEM/F12/10FB 培养液培养 BRL 细胞(ATCC )
(b)当细胞汇合时,用添加 2% FBS 的 LDF 置换 FD 培养液,在 37°C 条件下培养
(c)5 天后吸出 LDF,过滤,在 -20°C 冻存
(d)向细胞中加入新鲜的 LDF,5 天后重复此过程。条件化的 LDF 培养液可从同一个培养瓶中收集 3 次。然后,将细胞分开培养,使细胞再次汇合
1. 收集约 30 个受精后 8 h 的胚胎。
2. 通过链酶蛋白酶处理,除去绒毛膜 [ Sun et al.,1995a ]。
3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min,同时用吸管轻轻吹打,以便使细胞分散。
4. 加入 FBS (终浓度为 10 % ) ,终止胰蛋白酶的消化。
5. 离心(500 g ,10 min ) ,收集细胞。
6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培养液混悬细胞,然后将细胞移入 25 cm2 培养瓶。
7. 在 26°C 条件下,让细胞贴壁和汇合。
8. 当细胞汇合时,用同样的培养液传代。
9. 培养 2~3 代后,上皮细胞和成纤维细胞将混合出现。这些细胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基础培养液维持培养。通过不同的胰蛋白酶消化,为下一步培养筛选成纤维细胞。
(a)用胰蛋白酶处理细胞 1 min 以除去大部分成纤维细胞,保留贴在瓶壁上的上皮细胞。
(b)将成纤维细胞移入另 1 个培养瓶。当细胞汇合时,重复以上过程。
(c)培养 2~3 代后,细胞均为成纤维细胞。
10. 制备生长抑制的成纤维细胞饲养层:
(a)将细胞加入合适的培养皿或培养瓶,使成纤维细胞生长成为汇合的单层。
(b)将 10 μg/ml 丝裂霉素 C 加入成纤维细胞中,在 26°C 条件下处理 3 h。
(c)用 LDF 浸洗 3 次后,可将生长抑制的成纤维细胞用作斑马鱼胚细胞培养的伺养层。
来源:丁香实验