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细胞的原代培养

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6014

一、原代细胞培养原理

原代细胞培养是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞,如:动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养

• 掌握无菌操作技术

• 了解小鼠解剖操作技术

• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤

• 了解培养细胞的消化分散

• 了解倒置显微镜的使用

二、实验材料

• 实验动物:孕鼠或新生小鼠

• 液体:细胞生长液(内含20%小牛血清)

0.25%胰蛋白酶
平衡盐溶液
70%乙醇
• 器材:灭菌镊子、剪刀若干把

灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个
吸管若干支
酒精灯
原代细胞培养方法

三、胰酶消化法

(1)胰酶消化法操作步骤——取材

a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒,取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宫,置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜(若胚胎较大,应剪去头、爪),将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎,去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。


(2)胰酶消化法操作步骤——切割

a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中,用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎,直到成1mm3左右的小块,再用平衡盐溶液清洗,洗到组织块发白为止。

c. 静置,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。

(3)胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

c. 静置5-10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。

d. 1000rpm,离心10分钟,弃上清液。

e. 加入平衡盐溶液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。

f. 加入细胞生长液l-2ml(视细胞量),血球计数板计数。

e. 将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养。

(4)胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次。

b.静置,吸去上清,用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块,用吸管反复吹打组织块,使细胞分离,静置,使未分散的组织块下沉。

c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中(调整细胞浓度到5×105/ml左右),37℃下培养。

(注意:省略了离心、计数等步骤)

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