角质形成细胞的原代培养方法

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细胞培养 （Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

人角质形成细胞培养方法

A. 从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞

1. 在包皮环切术中，包皮放置于含有庆大霉素（Cat.No.15710）（浓度为5ug/ml）的Dk-SFMZ中。包皮可保存于2～8°C直到需要使用时。（注意：人类包皮可以保存于此种物质中2～8°C约5天而不会明显失去细胞活性。）

2. 包皮放置于含有庆大霉素（浓度为20ug/ml）的DPBS （不含Ca2+ or Mg2+ ）（Cat.No.14190）冲洗液中约1小时。包皮剪成2～4块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispase（Cat.No.17105）DPBS溶液中（添加5ug/ml的庆大霉素），在2～8°C条件下孵育18小时。

3. dispase孵育后，人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来，转移到加有5～10ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA（Cat.No.25300）的60mm有盖培养皿中。在36°C± 2°C条件下孵育大约15分钟，在这个过程中，每2～3分钟使用2ml的移液管吹打以帮助细胞解离。

4. 孵育以后，胰蛋白酶活性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Cat.No.17075）终止，大豆胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS（不含Ca2+ or Mg2+ ）配置，并在使用前无菌过滤。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。

5. 角质形成细胞使用5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，并使用血细胞计数器计算角质形成细胞浓度。原代细胞大约3×106 放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。细胞培养：松弛的瓶盖，36°C ± 2°C，5% CO2的潮湿空气中。

6. 角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次。

7. 由于原代角质形成细胞在供者之间生长特性的差异性，原代培养可能需要6～10天才能达到60%～75%的融合。

B. 人表皮角质形成细胞的传代

1. 达到60%～75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml 1：5000乙二胺四乙酸（Versene）冲洗。1～2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分钟。当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36°C ± 2°C再次孵育。

2. 当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。

3. 角质形成细胞使用3～5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约1～3×106 放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。

4. 细胞培养： 36°C ± 2°C，5% CO2的空气中。角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次，当达到60%～75%融合后，即可进行传代。

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